[發明專利]一種藥用天然產物的硬紫草轉基因毛狀根株系及其制備方法

在審

• 申請號: 201410657429.8
• 申請日: 2014-11-18
• 公開（公告）號: CN104450772A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 楊永華;趙胡;戚金亮;吳鳳瑤;朱煜;楊榮武;龐延軍
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;C12Q1/68
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 胡錫瑜

技術領域

本發明屬于植物生物技術領域，具體涉及一種藥用天然產物的硬紫草轉基因毛狀根株系及其制備方法。

背景技術

紫草屬紫草科多年生草本植物，為藥典收載臨床常用傳統中藥。1990年以后的《中華人民共和國藥典》中收錄了紫草科(Boraginaceae)3種植物，即軟紫草屬(Arnebia?Forsk)的新疆紫草[A.euchroma(Royle)Johnst.]，主產地為新疆；蒙紫草(黃花軟紫草，A.guttata?Bunge)，分布于我國西北至華北地區；紫草屬(Lithospermum)的硬紫草(Lithospermum?erythrorhizon)，在我國分布較廣。滇紫草(Onosma?paniculatum?Bur.et?Franch)在云南也常作紫草入藥。

紫草的活性成分主要分布于根，因而藥用價值最高，被稱為綠色黃金，成為行銷海內外的“道地藥材”，其主要活性成分紫草素亦稱紫草寧及其衍生物為萘醌類化合物，具有抗免疫缺血、抗腫瘤，治療風濕性關節炎、多硬化癥、艾滋病、過敏性紫癜、銀屑病以及保肝護肝、降血糖、降血粘度、降壓、解熱、鎮痛止痛等功效；多糖能增強機體特異性和非特異性免疫能力；紫草油具有治療燒傷、燙傷、急慢性膿耳、口腔潰瘍、褥瘡、痔瘡、急慢性濕疹以及促進傷口愈合等功效；紫草色素具有抗真菌作用，可作為生物毒素用于番茄葉霉病的防治。此外紫草素還可作為天然色素，被聯合國食品添加劑法典委員會列入食品、化妝品、藥品添加劑范圍，廣泛用于化妝品、防曬制品(如塑料制品)、食品、藥品等著色以及印染、洗滌劑的添加劑等，被國際譽為紅色素之王。紫草根油可直接入藥，制成軟膠囊可達藥用標準，籽油具降糖、降壓、降血脂等功效，還可作工業用油。因此，紫草已逐漸成為醫療、食品色素和化妝品及防病治病開發新藥研究的熱點。

隨著現代生物技術的發展，采用植物基因工程技術生產并提高人類所需的紫草寧，成為一種非常重要的替代手段。上世紀70年代，日本即已成功運用兩階段培養體系，即在光照條件下B5固體培養基上繁殖紫草細胞，然后在黑暗條件下利用M9液體生產培養基中培養紫草細胞進行工業化生產紫草寧。然而在植物細胞培養過程中普遍存在細胞系不穩定細胞生長緩慢，不耐剪切及代謝物產量低等問題又成為其實現規模化生產的瓶頸。

紫草毛狀根體系的建立可為大量生產天然活性物質提供有效的手段。發根農桿菌(Agrobacterium?rhizogenes)是屬于根瘤菌科農桿菌屬革蘭氏陰性菌，能侵染絕大多數雙子葉植物和少數單子葉植物誘發被侵染植物受傷部位產生毛狀根。發根農桿菌之所以具有這種致根特性是由于它具有能誘導毛狀根產生的Ri質粒，Ri質粒是發根農桿菌染色體外的一個大質?粒，帶有冠癭堿合成基因和生長素合成基因。毛狀根培養是較細胞培養產生天然產物具有更優越的實驗材料。此外，由于發根農桿菌攜帶的Ri質粒能將外源基因整合到寄主染色體、其誘導產生的毛狀根易獲得再生植株等優點，因此，建立特定植物的轉基因毛狀根體系，提高毛狀根中次生代謝物的產量，在定向植物分子育種方面具有廣泛應用前景。近年來利用發根農桿菌已轉化大約160多種植物，在40多種植物建立了毛狀根培養體系，特別是一些藥用植物建立了毛狀根轉基因體系，極大地方便了藥用天然產物生產及遺傳育種研究。

具有bHLH結構域的MYC蛋白是調節植物次生代謝物合成的一類重要轉錄因子，通常又稱bHLH轉錄因子。它們在調節玉米、擬南芥、各種觀賞植物及園藝植物花青素的生物合成方面具有重要作用。如玉米中編碼bHLH轉錄因子的基因R1具有調節谷粒糊粉層著色，調節花藥及胚芽鞘著色功能。擬南芥中參與調控花青素合成的bHLH蛋白主要包括TT8、GL3和EGL3，通過調節花青素原代謝途徑中的DFR和ANS/LDOX的表達而促進花青素原的合成。各種觀賞植物及園藝植物花青素的合成也是受bHLH轉錄因子調控的，如非洲菊(Gerbera?hybrida)GMYC1編碼的bHLH蛋白調節花冠和心皮中DFR的表達促進花青素的合成。bHLH蛋白通常與R2R3類MYB轉錄因子和WD40蛋白形成轉錄復合體MBW共同調節花青素代謝途徑中各種酶基因的表達，進而促進花青素等苯丙素類化合物的合成。

本課題組在前期工作中對在M9培養基上生產紫草寧及其衍生物的紫草細胞轉錄組深度測序發現一個高豐度的具有編碼bHLH結構域的轉錄本，結合文獻的相關報道，我們推測bHLH轉錄因子可能在紫草寧及其衍生物的合成調節方面具有重要作用。