[發明專利]一種用于香水椰子種苗純度的鑒定的特異SSR引物及鑒定方法

有效

• 申請號: 201410657128.5
• 申請日: 2014-11-18
• 公開（公告）號: CN104480197A
• 公開（公告）日: 2015-04-01
• 發明（設計）人: 楊耀東;吳翼;沈雁;肖勇;夏薇;李靜;周立霞
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院椰子研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京聯瑞聯豐知識產權代理事務所(普通合伙) 11411
• 代理人: 朱廣存

技術領域

本發明涉及香水椰子種苗栽培技術領域，特別是指一種用于香水椰子種苗純度的鑒定的特異SSR引物及鑒定方法。

背景技術

香水椰子是近年從泰國引進的椰子優良新品種，其主要特點是椰肉和椰汁具有一種用嗅覺可以聞到的糯米香味，香味明顯的植株其葉片用手指揉搓后也可聞到淡淡的糯米香味，極受消費者青睞。同時香水椰子產量高，投產早，鮮果市場價值高，經濟價值遠遠高于海南本地的椰子品種。

香水椰子授粉形式主要為自花授粉，但也存在風媒蟲媒等介質的傳粉。只要是自花授粉后，結出的椰果都會具有同母本一樣的香味；但是一旦風媒、蟲媒等介質帶來其它品種的花粉，經授粉后結出的椰果就不再具有香味，但椰果在外觀上同具有香味的椰果沒有區別。這種不具有香味的椰果成熟后如用于育苗，其后代不再具有香味，但其外觀性狀同具有香味的種苗沒有區別，無法用肉眼人為地剔除不純的種苗。這種不純的種苗如用于生產，從種植到結果大約四年時間都無法從外觀鑒定出來，必須到結果后方可從椰果有或無香味進行鑒定。這樣，勢必造成大量的人力、物力和財力的浪費。同時，由于出圃種苗純度得不到保證，嚴重影響廣大種植者對香水椰子的認可和種植的積極性，進而影響香水椰子大面積推廣工作的進行。

發明內容

本發明提出了一種用于香水椰子種苗純度的鑒定的特異SSR引物及鑒定方法，能夠在香水椰子苗期對種苗進行鑒定，將能夠結出香味椰果的香水椰子種苗鑒定出來。

本發明的技術方案是這樣實現的

一種用于香水椰子種苗純度的鑒定的特異SSR引物序列為，左引物序列為(5'to3')TGAAAACAAAAGATAGATGTCAG，右引物序列為(5'to3')GAAGATGCTTTGATATGGAAC。

一種香水椰子種苗純度的鑒定方法，包括以下步驟：

(1)香水椰子種苗葉片DNA的提取；

(2)利用特異SSR引物進行PCR擴增；

(3)PCR擴增產物經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離條帶；

(4)步驟(3)所得的電泳凝膠進行染色，拍照，即可根據條帶情況將具有香味的香水椰子種苗鑒定出來。

進一步，所述步驟(1)香水椰子種苗葉片DNA提取采用改良的CTAB法。

進一步，步驟(1)所述改良的CTAB法，具體操作為：在提取緩沖液和裂解緩沖液中同時加入PVP40和β-巰基乙醇，在提取過程中，利用氯仿-異戊醇進行2-3次抽提。

進一步，所述步驟(2)PCR擴增程序為94-96℃預變性1-3min進入擴增循環；94-96℃變性20-40s，50-60℃退火40-50s，70-75℃延伸1min；重復循環25-35次，72℃延伸5-10min。

進一步，所述步驟(4)染色用試劑為硝酸銀。

進一步，所述步驟(4)電泳凝膠上條帶顯示為2條的香水椰子種苗所結的椰果具有香味，電泳凝膠上條帶顯示為3條的香水椰子種苗所結的椰果不具有香味。

本發明的有益效果：

椰子樹從育苗到結出椰果需要3-4年時間，而傳統的育苗方法需要等到椰子結果才能將結出香味椰果的椰子植株挑選出來。自然條件下，如果不經過鑒定直接將種苗栽培，約有四分之一的種苗無法結出香味椰果。不能結出香味椰果的椰子樹經濟效益低，栽培過程中同樣需要花費大量的人力、物力和財力，如?果等到結果才發現不能結出香味椰果，無形中造成了種植戶經濟上的損失。香水椰子種苗純度不高，也會挫傷廣大種植戶的積極性，阻礙了香水椰子的大面積推廣。本發明采用SSR分子標記技術對香水椰子種苗進行純度鑒定，可以在種苗期將能夠結出香味椰果的香水椰子種苗和不能結出香味椰果的香水椰子種苗區分開來，無需等到椰子樹結果之后再區分，能夠保證出圃的香水椰子的種苗純度，避免了在椰子樹栽培過程中大量的人力、物力和財力的浪費，具有重大的經濟意義。同時，香水椰子種苗純度的提高，能夠極大地調動了種植戶的積極性，對香水椰子的推廣具有顯著的促進作用。

附圖說明

圖1本發明實施例1聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，編號1-10、13和14為椰果帶有香味的香水椰子種苗；12和15-23為椰果不帶香味的香水椰子種苗；11為marker。

具體實施方式

下面將結合本發明實施例，對本發明中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

實施例1