[發(fā)明專(zhuān)利]一步法反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)和分型埃博拉病毒5種亞型的引物、探針及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410655921.1
• 申請(qǐng)日: 2014-11-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104313191A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-01-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王成明;陸光武;張繼壘
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 揚(yáng)州大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/70
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 南京鐘山專(zhuān)利代理有限公司 32252
• 代理人: 戴朝榮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于埃博拉病毒保守區(qū)間、可以對(duì)埃博拉病毒5種亞型進(jìn)行檢測(cè)和分型的引物、探針及試劑盒。

背景技術(shù)

埃博拉病毒病(Ebola?virus?disease,EVD)是由埃博拉病毒(Ebola?virus，EBOV)引起的一種傳染性強(qiáng)、死亡率極高的急性出血性、人與非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物共患的傳染病。因1976年在非洲剛果民主共和國(guó)(前扎伊爾)北部的埃博拉河(Ebola)沿岸首次暴發(fā)流行而得名。EVD的主要特征是發(fā)熱迅速，頭痛和肌肉疼痛，之后產(chǎn)生咽喉腫痛，惡心，嘔吐腹瀉以及腹痛，將近一半病人會(huì)出現(xiàn)出血癥狀。此病發(fā)病急，病程短，死亡率高達(dá)30％-90％，是一種烈性病毒性傳染病。EVD目前呈現(xiàn)地方性流行，主要流行于非洲大陸，我國(guó)尚未有本病的報(bào)道。EBOV已經(jīng)通過(guò)非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)可以通過(guò)接觸傳播和空氣傳播。因此，自然界各種因素都有可能造成EVD的爆發(fā)。EVD的病原體為EBOV，在分類(lèi)上屬于絲狀病毒科(Filoviridae)、埃博拉病毒屬(Ebolavirus)成員，為單股負(fù)鏈非節(jié)段RNA病毒。目前埃博拉病毒有5種不同的亞型：埃博拉扎伊爾型(Zaire?ebolavirus)，埃博拉蘇丹型(Sudan?ebolavirus)，埃博拉本迪布焦型(Bundibugyo?ebolavirus)，埃博拉塔伊森林型(Forest?ebolavirus)，埃博拉萊斯頓型(Reston?ebolavirus)。目前埃博拉病毒的常用檢測(cè)方法有：

(1)電鏡檢測(cè)。取病人或猴的病料接種于Vero-98等細(xì)胞，37℃培養(yǎng)6-7天后鏡檢?；蛘?，取病人或猴的病變臟器用電子顯微鏡直接觀察病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)。電鏡檢測(cè)方法需要固定、脫干、墊入、分割和染色等步驟，耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)，而且埃博拉病毒與馬爾堡病毒同為絲狀病毒科，具有相似的形態(tài)，容易產(chǎn)生誤診，同時(shí)對(duì)操作人員要求也較高。

(2)血清學(xué)檢測(cè)。血清學(xué)試驗(yàn)多采用免疫熒光技術(shù)，另外還建立了固相間接免疫酶試驗(yàn)、放射免疫試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和蝕斑減少中和試驗(yàn)等方法。血清學(xué)檢測(cè)方法的基礎(chǔ)是抗原抗體的特異反應(yīng)。如檢測(cè)抗原，除了要求抗體為單抗或多抗，是特異的外，還要求待測(cè)抗原上必須存在有能與所用抗體結(jié)合的抗原決定簇，如果因?yàn)榛蛲蛔儗?dǎo)致某些位點(diǎn)的不表達(dá)，或者結(jié)合位點(diǎn)因?yàn)槟承┰虮环忾]或阻斷，都會(huì)影響抗體與抗原的結(jié)合，造成假陰性結(jié)果；如檢測(cè)抗體，則要求所用包被抗原應(yīng)盡可能包含所有的特異抗原決定簇，同時(shí)又盡可能不含有非特異的成分，這一點(diǎn)往往由于技術(shù)水平的限制而難以完全做到。另外，不同埃博拉病毒亞型以及埃博拉病毒和絲狀病毒科其他病毒之間存在交叉反應(yīng)。因此，從某種意義上來(lái)說(shuō)，血清學(xué)實(shí)驗(yàn)的假陽(yáng)性和假陰性是不能完全避免的，從而影響了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

(3)分子生物學(xué)檢測(cè)。此類(lèi)檢測(cè)方法以PCR檢測(cè)為主，尤其是反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse?transcription-polymerase?chain?reaction,RT-PCR)技術(shù)的發(fā)展，為快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)埃博拉病毒以及其他傳染病提供了更可靠的診斷方法。RT-PCR方法可以在病毒感染的各個(gè)時(shí)期(尤其是抗體產(chǎn)生初期)的各種臨床樣品中檢測(cè)到病毒核酸，這就為傳染病尤其是像埃博拉病毒病這種烈性傳染病的預(yù)防、診斷和控制奠定了基礎(chǔ)。但目前為止，仍然沒(méi)有一種RT-PCR方法可以同時(shí)檢測(cè)和分型所有5種埃博拉病毒亞型。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種高度靈敏、特異、快速檢測(cè)和分型埃博拉病毒5種亞型的引物、探針及試劑盒,同時(shí)確保此系統(tǒng)不擴(kuò)增其它非埃博拉病毒的微生物，尤其是與其相近的其他病原體，如馬爾堡病毒(Marburg?virus)等。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：