[發(fā)明專利]一種黃熱病毒的微流體基因芯片檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410654941.7
• 申請(qǐng)日: 2015-08-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104498621A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-07-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 田楨干;李深偉;張子龍;周璇;章琪;李平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中華人民共和國(guó)上海出入境檢驗(yàn)檢疫局
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 上海泰能知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 31233
• 代理人: 黃志達(dá)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及體外診斷試劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黃熱病毒的微流體基因芯片檢測(cè)方法。

背景介紹

隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化和貿(mào)易自由化，國(guó)外的醫(yī)學(xué)媒介生物通過(guò)先進(jìn)的交通工具和國(guó)際貿(mào)易，可以迅速把傳染病從一個(gè)國(guó)家或地區(qū)傳向全球，造成國(guó)際間傳播。近年來(lái),新發(fā)病毒性傳染病在世界各國(guó)頻頻暴發(fā)流行,對(duì)人類健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅,給社會(huì)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。這些新發(fā)病毒性傳染病的頻發(fā)給我們敲響了警鐘,加強(qiáng)對(duì)其的研究和監(jiān)測(cè)以及早預(yù)防控制是至關(guān)重要的。

蟲(chóng)媒病毒是一類通過(guò)吸血節(jié)肢動(dòng)物叮咬敏感脊椎動(dòng)物宿主而在人畜之間進(jìn)行傳播的病毒，其中100多種可以導(dǎo)致人畜疾病，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致死亡。黃熱病毒屬于蟲(chóng)媒病毒，B組，為RNA病毒、呈球形、長(zhǎng)約20～60納米。在—70℃下保存10年仍有活力，在室溫下容易滅活，0℃下經(jīng)48小時(shí)失去活性。主要由庫(kù)蚊和伊蚊傳播。雖未在我國(guó)出現(xiàn)，但是庫(kù)蚊和伊蚊在我國(guó)分布廣泛，為其傳入提供了方便。黃熱病毒引起的急性傳染病黃熱病，主要流行于非洲和中、南美洲，3-4月份的病例較多。黃熱病是黃熱病毒引起的急性傳染病。臨床以發(fā)熱、黃疽、蛋白尿、相對(duì)緩脈和出血等為特征。1907年黃熱病被《國(guó)際衛(wèi)生公約》列為國(guó)際檢疫傳染病。近十年來(lái)，在非洲和拉丁美洲的十幾個(gè)國(guó)家先后發(fā)生了數(shù)次黃熱病散發(fā)流行，而在我國(guó)尚無(wú)發(fā)病。對(duì)這些病原的快速檢測(cè)技術(shù)的研究目前尚屬空白。隨著我國(guó)商貿(mào)、旅游業(yè)的快速發(fā)展,境內(nèi)外人員交往日益密切,以及動(dòng)物的進(jìn)口等影響,黃熱病毒輸入的危險(xiǎn)性日益增高。因此,盡快建立快速簡(jiǎn)便、特異敏感的檢測(cè)方法對(duì)防范黃熱病毒的輸入具有重要意義。

基因芯片采用微加工和微電子技術(shù)將大量的人工設(shè)計(jì)好的基因片段有序地、高密度地排列在纖維膜等載體上。基因芯片可以同時(shí)固定大量的探針?lè)肿樱梢栽谝淮螌?shí)驗(yàn)中檢出多種病原體；同時(shí)檢測(cè)的靈敏度、特異性和快速便捷性也很高，因而在病原體分析檢測(cè)中有很好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明整合了逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR和微陣列Microarray這兩種強(qiáng)大的分子生物學(xué)技術(shù)，將RT-PCR與微陣列芯片雜交反應(yīng)腔整合到一張芯片上，PCR雜交的探針直接固定在微陣列中的雜交艙中。操作簡(jiǎn)單，節(jié)省時(shí)間，靈敏度高，特異性好。為黃熱病毒的檢測(cè)提供了快速，簡(jiǎn)便，靈敏的微流體基因芯片檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種快速、靈敏的黃熱病毒微流體基因芯片檢測(cè)方法。通過(guò)本發(fā)明可大幅度提高進(jìn)出口口岸一線檢驗(yàn)檢疫人員的檢測(cè)效率，既可減少工作量、又可最大限度地解決傳統(tǒng)檢測(cè)方法可能存在的陽(yáng)性漏檢問(wèn)題，從而最大限度地防止外來(lái)輸入性傳染病的發(fā)生。

本發(fā)明所提供的黃熱病毒微流體基因芯片檢測(cè)方法，包括如下檢測(cè)步驟：

(1)樣本混勻處理；

(2)RNA核酸提取；

(3)RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)：

a.RT-PCR反應(yīng)體系包括：RT-PCR反應(yīng)液,特異性正、反向引物混合液，逆轉(zhuǎn)錄酶/DNA聚合酶，DEPC水,RT-PCR質(zhì)控品,樣本RNA核酸；

b.將RT-PCR反應(yīng)液加入已固化特異性探針的芯片內(nèi)，將芯片放入反應(yīng)室內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；

所述的特異性引物和探針是根據(jù)YFVgp1基因特異性引物擴(kuò)增區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)，能夠區(qū)別其他病毒株，特異性引物和探針為：

YFV-F:5-AGGTGCATTGGTCTGCAAATCGAG-3(SEQ?ID?NO?1)

YFV-R:5-CCCTGAGCTTTDCGACCAGACAT-3(SEQ?ID?NO?2)

YFV-Probe:5-AGCAGAGAACTGACCA-3(SEQ?ID?NO?3)

(4)雜交：RT-PCR擴(kuò)增完后，加入雜交反應(yīng)液，使雜交液和擴(kuò)增液都進(jìn)入到雜交艙內(nèi)進(jìn)行雜交反應(yīng)；

(5)清洗：雜交后的芯片用洗液沖洗，直接用熒光掃描儀檢測(cè)；

(6)結(jié)果判定：根據(jù)雜交結(jié)果，判定感染情況。

步驟(2)中所述的RNA提取可使用病毒RNA提取試劑盒提取。取140ul血液樣本，裂解后，按照試劑盒說(shuō)明書中的提取步驟提取RNA。

步驟(3)中所述的RT-PCR反應(yīng)體系為：2X?RT-PCR反應(yīng)液12.5ul,引物混合液2.5ul，14mM?MgSO42.5ul，PCR?Grade?H2O?1ul,逆轉(zhuǎn)錄酶/DNA聚合酶1ul,PCR質(zhì)控2ul,樣本3.5ul。