[發明專利]一種黃熱病毒的微流體基因芯片檢測方法

在審

• 申請號: 201410654941.7
• 申請日: 2015-08-04
• 公開（公告）號: CN104498621A
• 公開（公告）日: 2015-07-29
• 發明（設計）人: 田楨干;李深偉;張子龍;周璇;章琪;李平
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國上海出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達

1.一種黃熱病毒的微流體基因芯片檢測方法，其特征在于：包括如下檢測步驟：

(1)樣本混勻處理；

(2)RNA核酸提取；

(3)RT-PCR擴增反應：

a.RT-PCR反應體系包括：RT-PCR反應液,特異性正、反向引物混合液，逆轉錄酶/DNA聚合酶，DEPC水,RT-PCR質控品,樣本RNA核酸；

b.將RT-PCR反應液加入已固化特異性探針的芯片內，將芯片放入反應室內進行擴增反應；

所述的特異性引物和探針是根據YFVgp1基因特異性引物擴增區內設計，能夠區別其他病毒株，特異性引物和探針為：

YFV-F:5-AGGTGCATTGGTCTGCAAATCGAG-3(SEQ?ID?NO?1)

YFV-R:5-CCCTGAGCTTTDCGACCAGACAT-3(SEQ?ID?NO?2)

YFV-Probe:5-AGCAGAGAACTGACCA-3(SEQ?ID?NO?3)

(4)雜交：RT-PCR擴增完后，加入雜交反應液，使雜交液和擴增液都進入到雜交艙內進行雜交反應；

(5)清洗：雜交后的芯片用洗液沖洗，直接用熒光掃描儀檢測；

(6)結果判定：根據雜交結果，判定感染情況。

2.根據權利要求1所述的黃熱病毒的微流體基因芯片檢測方法，其特征在于：步驟(2)中所述的RNA提取使用病毒RNA提取試劑盒提取；所述的RNA提取步驟為:取140ul血液樣本，裂解后，按照試劑盒說明書中的提取步驟提取RNA。

3.根據權利要求1所述的黃熱病毒的微流體基因芯片檢測方法，其特征在于：步驟(3)中所述的PCR反應體系為：2X?RT-PCR反應液12.5ul,引物混合液2.5ul，14mM?MgSO42.5ul，PCR?Grade?H2O?1ul,逆轉錄酶/DNA聚合酶1ul,PCR?Control?2ul,Sample?3.5ul。

4.根據權利要求1所述的黃熱病毒的微流體基因芯片檢測方法，其特征在于：步驟(3)中所述的RT-PCR擴增的反應條件是：50℃逆轉錄20min；95℃預變性2min；95℃變性10s，60℃退火40s，72℃延伸50s；11個循環，每個循環退火溫度降低1℃，直至退火溫度變成50℃；95℃變性15s，56℃退火40s，72℃延伸50s，40個循環。

5.根據權利要求1所述的黃熱病毒的微流體基因芯片檢測方法，其特征在于：步驟(4)中所述的雜交反應條件是：95℃預變性3min；58℃雜交30min。

6.根據權利要求1所述的黃熱病毒的微流體基因芯片檢測方法，其特征在于：步驟(5)中所述的清洗條件是3000rpm，離心2min。

7.根據權利要求1所述的黃熱病毒的微流體基因芯片檢測方法，其特征在于：步驟(3)所述的PCR擴增與步驟(4)所述的雜交在芯片儀上完成。