[發明專利]一株產甲殼素脫乙酰酶菌株及在發酵產甲殼素脫乙酰酶中的應用

在審

• 申請號: 201410654845.2
• 申請日: 2015-08-04
• 公開（公告）號: CN104498365A
• 公開（公告）日: 2015-07-29
• 發明（設計）人: 婁文勇;程建華;宗敏華;徐培
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N9/80;C12R1/66
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 宮愛鵬

技術領域

本發明公開了一株產甲殼素脫乙酰酶的菌株以及利用該菌株發酵產甲殼素脫乙酰酶的方法，屬于生物技術領域。

背景技術

甲殼素(chitin)是地球上僅次于纖維素的第二大生物多糖，也是地球上唯一大量存在的天然堿性多糖，它廣泛存在于昆蟲的甲殼，甲殼綱動物蝦蟹的甲殼，真菌(酵母、霉菌)的細胞壁以及植物的細胞壁中。每年甲殼素的生物合成量約為100多億噸。

甲殼素是由N-乙酰氨基-D-葡萄糖通過β-(1,4)糖苷鍵連接而成的線性聚合物，分子中存在大量的氫鍵，溶解性能很差。殼聚糖是甲殼素分子中的乙酰氨基部分或全部脫除后的產物，由于其分子中存在大量的自由氨基，分子帶正電荷，化學性質活波，溶解性能得到很大改善，因而在國內外的應用十分廣泛。如：用作污水處理劑，食品的增稠劑和防腐劑，可降解包裝材料，超濾膜等；也可作為酶和細胞的固定化載體、緩釋材料等。另外，殼聚糖在醫藥領域受到越來越多的關注，可用于制作人造皮膚，作為膳食纖維添加到保健品中，可以降血脂，促進骨骼生長等。目前殼聚糖的生產主要采用高溫濃堿法，但該方法對環境污染較大，同時存在產品脫乙酰度不均勻、分子量變化大，生產成本高等問題。

甲殼素脫乙酰酶(chitin?deacetylase,E.C.3.5.1.41,簡稱CDA)可以催化甲殼素分子中乙酰氨基的水解，將甲殼素轉變為殼聚糖。用其替代現有的濃堿法生產殼聚糖，不僅可以解決目前殼聚糖生產中存在的環境問題，同時還可以得到分子量分布范圍窄、乙酰化均勻等特性的高質量的殼聚糖。自1974年Araki等最初從Mucor?rouxii中發現甲殼素脫乙酰酶存以來，研究者相繼從多種細菌、霉菌及釀酒酵母中發現該酶的存在。但是大部分菌株所產甲殼素脫乙酰酶為胞內酶，且酶活力、產率較低，這將影響該酶在甲殼素生物轉化過程中的應用。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有技術的不足，提供一種產甲殼素脫乙酰酶的?菌株Aspergillus?versicolor?X，同時還提供了一種利用雜色曲霉(Aspergillus?versicolor)X發酵產酶的方法。

本發明實現上述目的的技術方案是：

Aspergillus?versicolor?X是以山東某生物制品廠甲殼素生產廢棄物土壤為原材料，采用連續稀釋涂布平板法篩選分離，其中以4-硝基乙酰苯胺為顯色劑，后經分離純化獲得。已于2014年10月8日保藏于中國典型培養物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏號為CCTCC?NO:M2014459，保藏地址為中國武漢武漢大學(郵編為430072)。具體篩選步驟如下：

(1)菌種的初篩及純化

將原材料(甲殼素生產廢棄物土壤)以10％(w/v)的量加入無菌生理鹽水中，震蕩20min，靜置15min，取上清經連續稀釋涂布于固體篩選培養基。培養基組成為膠體甲殼素20g/L，磷酸氫二鉀0.7g/L，磷酸二氫鉀0.3g/L，硫酸鎂0.5g/L，氯化鈉0.1g/L，4-硝基乙酰苯胺(PN)0.4g/L，瓊脂20g/L。30℃恒溫培養60h。

挑取固體篩選培養基中，菌落四周出現黃色的單一菌落，分別于固體篩選培養基中劃線分離，連續分離至單一菌落特征一致。

(2)菌種的復篩?

將初篩得到的菌種分別接種至液體培養基中，培養基組成同初篩培養基(不添加PN，瓊脂)，30℃，160rpm恒溫培養72h，分離收集上清液(粗酶)測酶活。每種菌重復2瓶。從中選取產酶活力最高的菌株。

CDA活力測定：采用MBTH方法測定。在試管中加入100μl?50mM?pH7.0PBS緩沖液，然后加入100μl含100μgN-乙酰氨基殼六糖的水溶液及50μl經離心分離的發酵上清液，于30℃下反應30min，加入250μl?5％KHSO₄終止反應。在反應液中加入250μl?5％NaNO₂，間斷地搖動15min，再加入250μl12.5％氨基磺酸氨，5min后加入250μl?0.5％MBTH，并在沸水中加熱3min，冷卻后加入250μl?0.5％FeCl₃，30min后于650nm處測定吸光值。以標準氨基葡萄糖鹽酸鹽作標準曲線。一個酶活單位確定為：以N-乙酰氨基殼六糖為底物，每分鐘產生1μg氨基葡萄糖所需要的酶量為一個單位。

(3)菌種鑒定

分子生物學鑒定委托廣東省微生物分析檢測中心進行。DNA序列如Seq?ID?No：1所示。