[發明專利]一種前交叉韌帶殘端來源的間充質干細胞的制備方法

在審

• 申請號: 201410654515.3
• 申請日: 2014-11-17
• 公開（公告）號: CN104357386A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發明（設計）人: 付維力
• 申請（專利權）人: 四川大學華西醫院
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

技術領域

本發明涉及一種韌帶殘端來源的間充質干細胞的制備方法。

背景技術

前交叉韌帶損傷在臨床骨科及運動醫學領域非常常見，尤其是對于高水平的專業運動員。關節鏡下前交叉韌帶重建目前被認為是廣泛接受的治療前交叉韌帶斷裂的“金標準”，用于前交叉韌帶重建的肌腱移植物(包括自體、異體和人工合成的韌帶)在體內經歷急性炎性反應、再血管化、基質合成、膠原重塑4個“韌帶化”整合階段。前交叉韌帶重建的目標是恢復膝關節穩定的功能，但是很多接受前交叉韌帶重建的患者依然發生關節退變。成功的前交叉韌帶重建的前提條件是移植物與宿主組織的生物學整合。一些研究發現前交叉韌帶/后交叉韌帶的保留殘端組織的生物增強重建有利于韌帶的愈合。

種子細胞為基礎的組織工程及再生醫學策略為韌帶的生物學再生帶來新的希望。目前用于韌帶再生的種子細胞主要為成體間充質干細胞(mesenchymal?stem?cells，MSC)。

MSC因其來源廣泛、優良的自我更新、多向分化潛能、免疫調節、定向歸巢以及無倫理道德方面爭議等優點。在體內外適當的條件下，MSC能分化為中胚層、甚至內外胚層的組織細胞。但是，另一方面，MSC在體外培養擴增過程中可能出現轉化、衰老或凋亡現象，常伴隨細胞增殖能力和分化潛能的下降，逐漸失去其“干性”特點。再者，MSC最傳統經典主要來源是骨髓，但其MSC的含量非常低(僅占有核細胞的0.01％～0.001％)，且存在供區并發癥等缺點。因此開發其他來源的MSC用于韌帶的修復重建非常有意義。盡管還可以從其他組織，如脂肪或滑膜組織分離間充質干細胞，但是這些間充質干細胞相對骨髓間充質干細胞的干性較弱，用于韌帶修復時，不能確切的分化為韌帶細胞，導致修復效果不佳。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供了一種前交叉韌帶殘端來源的間充質干細胞的制備方法和鑒定。

本發明前交叉韌帶殘端組織來源的間充質干細胞的分離方法，其包括如下步驟：

(1)取前交叉韌帶殘端組織，剪成組織碎塊，采用濃度為0.2～0.6％(w/v)的I型膠原酶溶液消化4～6h；

(2)終止消化，用100～400目篩網過濾，1000～2000rpm離心4～10min，棄上清，PBS洗滌3次，重懸于間充質干細胞培養基中，置于37℃、5％CO₂條件下培養，2～3天后棄去非貼壁細胞和碎片，換液，此后每3～4天換液一次，在細胞融合度為80％～90％時收獲細胞，即可。

前交叉韌帶殘端：前交叉韌帶損傷后斷端的殘留組織。

步驟(1)中，所述組織碎塊的體積為1～5mm³。

步驟(1)中，所述消化是在37℃、30～300轉/分條件下振蕩消化。

步驟(1)中，所述I型膠原酶溶液的濃度為0.2％(w/v)；所述I型膠原酶溶液是包含膠原酶的低糖DMEM培養基。

步驟(2)中，所述終止消化的方法是：加入細胞懸液1/2～3倍體積的含10％FBS的低糖DMEM培養基。

步驟(2)中，所述篩網為200目篩。

步驟(2)中，所述離心的轉速為1200rpm，離心時間為5min。

步驟(2)中，細胞培養時，環境的相對濕度為95％。

步驟(2)中，所述間充質干細胞培養基是添加有10％FBS，3.7g/LNaHCO₃，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，25ng/ml兩性霉素B，2mM?L-谷氨酰胺的低糖DMEM培養基。

本發明還提供了前述方法分離得到的間充質干細胞。

FBS：胎牛血清。

目前，通常認為間充質干細胞存在于骨髓、外周血、臍血、松質骨、脂肪組織、滑膜和臍帶中，但是用這些來源的間充質干細胞用于半月板修復均存在缺陷，如，骨髓間充質干細胞含量非常低(僅占有核細胞的0.01％～0.001％)，且存在供區并發癥等缺點，而其他組織來源的干細胞又不能確切分化為半月板細胞，導致修復效果不好。

然而，發明人卻從前交叉韌帶殘端組織分離得到的間充質干細胞，綜合前交叉韌帶殘細胞的穩定表型和間充質干細胞“干性”特征兩者的優點，可以克服前述其他來源間充質干細胞用于修復前交叉韌帶殘存在的問題。

本發明前交叉韌帶殘端間充質干細胞，既具有間充質干細胞通常都具有的干性，又來源于韌帶組織，可以制備成為韌帶組織修復用種子細胞，修復韌帶組織，臨床應用前景良好。