[發(fā)明專利]一種重組表達(dá)葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410653076.4
• 申請日: 2014-11-17
• 公開（公告）號: CN104357343A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳堅;劉曉筱;張娟;堵國成;顧磊
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N9/04;C12R1/645
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 張勇

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種重組表達(dá)葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

葡萄糖氧化酶(Glucose?Oxidase，簡稱GOD，E.C.1.1.3.4)是一種黃素糖蛋白，在有氧條件下能專一性地催化β-D-葡糖生成葡萄糖酸和過氧化氫。GOD廣泛分布于動植物和微生物體內(nèi)。由于微生物生長繁殖快、來源廣，是生產(chǎn)GOD的主要來源，主要生產(chǎn)菌株為黑曲霉和青霉。目前GOD的應(yīng)用領(lǐng)域不斷拓展，國內(nèi)外市場需求量急劇增加。目前GOD的應(yīng)用領(lǐng)域不斷拓展，國內(nèi)外市場需求量急劇增加。目前GOD基因已經(jīng)在畢赤酵母GS115、大腸桿菌、瑞氏木霉等中得到表達(dá)，但還未見其在非常規(guī)酵母解脂耶氏酵母中進(jìn)行表達(dá)研究，而解脂耶氏酵母被認(rèn)為是安全的，因此，能用于食品和藥物生產(chǎn)上。

解脂耶氏酵母Pold菌系中，編碼能水解其它蛋白質(zhì)的AEP基因被剔除，使得外源蛋白能更好地表達(dá)。人們將Pold系改造，生成一系列的派生菌系，如Polh、Polg、Polf。Polh、Polg在Pold系基礎(chǔ)上進(jìn)行改造，只有一個營養(yǎng)缺陷型基因。Polg被改造為適合以pBR322為基礎(chǔ)的質(zhì)粒整合的菌系，Polh將穿梭質(zhì)粒的細(xì)菌部分在整合入酵母前剔除掉，形成酵母框。它們均在Pold系的基礎(chǔ)上均被剔除了酸性蛋白酶基因，消除了全部蛋白酶活性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一株能夠高產(chǎn)葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母重組菌株，是以pINA1297為載體表達(dá)編碼葡萄糖氧化酶的基因。

所述葡萄糖氧化酶基因來源黑曲霉Aspergillus?niger?CCTCC?NO：M2011291，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

所述解脂耶氏酵母重組菌是以解脂耶氏酵母Po1h為出發(fā)菌株。

本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種構(gòu)建所述解脂耶氏酵母重組菌株的方法，主要包括以下步驟：(1)構(gòu)建重組表達(dá)載體pINA1297-GOD；(2)醋酸鋰法轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母po1h；(3)重組菌株的篩選；(4)重組菌株的驗證。

本發(fā)明要解決的第三個技術(shù)問題是提供一種應(yīng)用所述解脂耶氏酵母重組菌株發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖氧化酶的方法，是將重組菌接種到種子液體培養(yǎng)基YPD中，培養(yǎng)24h后以10％的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基PPB中，于28℃、200r/min搖床中培養(yǎng)168h。

本發(fā)明所得解脂耶氏酵母重組菌可利用蔗糖等廉價的作碳源，適合高密度發(fā)酵。且解脂耶氏酵母被認(rèn)為是安全的，適用于食品、SCP等的工業(yè)化生產(chǎn)。此外，解脂耶氏酵母表達(dá)體系選用營養(yǎng)缺陷型作為重組菌的篩選標(biāo)記，也避免了抗生素危險人體健康的風(fēng)險。因而利用該酵母可構(gòu)建食品安全級產(chǎn)葡萄糖氧化酶菌株。

具體實施方式

主要試劑：蛋白胨和酵母粉購自O(shè)XIOD公司；E.coli感受態(tài)試劑盒、Primer?Star?DNA聚合酶、膠回收試劑盒、DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、DNA突變試劑盒均購自TaKaRa公司(大連)；質(zhì)粒提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；酵母基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；SDS-PAGE試劑盒和蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量購于碧云天生物技術(shù)研究所(南通)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

所需培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20；蛋白胨20；酵母粉10。YNB培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20；YNB1.7；硫酸銨5。PPB培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖20；酵母提取物1.32；氯化銨1.32；磷酸二氫鉀0.32；無水硫酸鎂0.132；維生素B13.34×10-4；溶于檸檬酸鹽緩沖液pH6.0中。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加2％瓊脂粉。

Y.lipolytica種子培養(yǎng)條件：從-80℃保藏的工程菌甘油管點至YPD固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)過夜，用接種針挑取單菌落接種于用250mL三角瓶裝有25mL的YPD液體培養(yǎng)基中，于28℃培養(yǎng)18～24h，轉(zhuǎn)速為200rpm。

Y.lipolytica發(fā)酵培養(yǎng)條件：采用PPB培養(yǎng)基，培養(yǎng)基用250mL三角瓶裝液25mL，接種量為10％，于28℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200rpm，培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束。

酶活測定方法：

酶活力單位定義：在30℃，pH6.0的條件下，1min從1μmol的β-D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸和H₂O₂所需的酶量為一個葡萄糖氧化酶酶活力單位，以U/mL表示。