[發(fā)明專利]用于鑒別和制備(R)-特異性ω-轉(zhuǎn)氨酶的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410652407.2
• 申請日: 2010-08-13
• 公開（公告）號: CN104480155B
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馬蒂亞斯·赫內(nèi);烏韋·博恩朔伊爾;卡倫·羅賓斯;塞巴斯蒂安·舍茨勒
• 申請（專利權(quán)）人: 羅扎股份公司
• 主分類號: C12P13/00
• 分類號: C12P13/00;C40B50/06
• 代理公司: 隆天知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 72003
• 代理人: 吳小瑛;王芝艷

本發(fā)明涉及用于鑒別和制備(R)?特異性ω?轉(zhuǎn)氨酶的方法，具體而言，用于篩選、制備和表征(R)?選擇性ω?轉(zhuǎn)氨酶的方法，由此獲得的ω?轉(zhuǎn)氨酶及其在各種氨基轉(zhuǎn)移過程中的應(yīng)用。

本申請是申請?zhí)枮?01080039297.2，申請日為2010年8月13日，發(fā)明名稱為“用于鑒別和制備(R)-特異性ω-轉(zhuǎn)氨酶的方法”的中國專利申請的分案申請。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于篩選、表征和制備(R)-特異性ω-轉(zhuǎn)氨酶的方法，由此獲得的ω-轉(zhuǎn)氨酶及其在各種氨基轉(zhuǎn)移過程中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

手性胺在制藥、農(nóng)用化學(xué)和化學(xué)工業(yè)中發(fā)揮著重要作用。它們常被用作中間體或合成子(synthones)以制備各種生理學(xué)，如藥學(xué)活性物質(zhì)，如頭孢菌素或吡咯烷衍生物。在手性胺的眾多應(yīng)用中，僅有一種特定的光學(xué)活性形式((R)或(S)對映體)具有生理學(xué)活性。因此，需要提供一種制備光學(xué)活性形式的手性胺的方法。

這些需求通過以下方法得到部分滿足，即通過加入手性羧酸使非對映體鹽結(jié)晶來制備手性胺(Breuer et al.,Angewandte Chemie(2004)116,806-843)。其它化學(xué)方法使用通過還原含C＝N雙鍵的前手性前體的對映選擇性合成。

在已用于合成光學(xué)活性氨基酸和胺的若干酶促方法中，由于其用于光學(xué)活性胺的不對稱合成的潛力，ω-轉(zhuǎn)氨酶(ω-TAs)最近已得到更多關(guān)注，其常被用作多種藥物制備的結(jié)構(gòu)單元(building blocks)。

ω-轉(zhuǎn)氨酶是PLP(磷酸吡哆醛)依賴性酶，其催化氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。當(dāng)采用ω-轉(zhuǎn)氨酶時，主要可經(jīng)由兩種反應(yīng)策略來制備所謂的對映體富集和/或純光學(xué)活性胺：(i)從酮起始的不對稱合成，和(ii)從外消旋胺起始的動力學(xué)拆分。雖然ω-轉(zhuǎn)氨酶總體上顯示出良好的對映選擇性，但它們尚未被頻繁地用在不對稱合成中，盡管在不對稱合成中理論上可能的產(chǎn)率是100％。使用ω-轉(zhuǎn)氨酶的不對稱合成的一個特殊要求是平衡向產(chǎn)物側(cè)移動，特別是當(dāng)使用諸如丙氨酸等氨基酸作為氨基供體時，因為在此情況下平衡狀態(tài)在底物(酮、丙氨酸)側(cè)，而不在產(chǎn)物(胺、丙酮酸鹽)側(cè)；另一個要求是酶必須具有最佳的對映選擇性，而ω-轉(zhuǎn)氨酶并非一向如此。因此，ω-轉(zhuǎn)氨酶主要用于外消旋胺的動力學(xué)拆分，其中不需要最佳的對映選擇性。因此，雖然已經(jīng)研究了外消旋胺的動力學(xué)拆分，但50％最大產(chǎn)率的限制很大程度上阻礙了其應(yīng)用。另一方面，不對稱合成需要將不利的平衡向合成光學(xué)純胺的單個對映體的方向移動，這是能夠在工業(yè)規(guī)模上使用轉(zhuǎn)氨酶的有效方法的一個重要先決條件。WO2007/093372公開了這類方法。

EP 0 987 332 A1公開了通過微生物酶，特別是源自節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)的(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶來制備光學(xué)活性氨基化合物，即(R)-氨基化合物的方法。EP 1 038953 A1公開了另一種(R)-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶，但其源自金色分支桿菌(Mycobacteriumaurum)。

Iwasaki等(Biotechnol.Let.2003(25),1843-1846)、Koszelewski等(Adv.Synth.Catal.2008(350),2761-2766)和Iwasaki等(Appl.Microbiol.Biotechnol.2006(69),499-505)公開了源自節(jié)桿菌的R-特異性轉(zhuǎn)氨酶。通常通過選擇得自于如土壤樣品的微生物并在培養(yǎng)中將其富集來完成提供有用(S)-或(R)-選擇性轉(zhuǎn)氨酶的微生物的鑒別(Jun等,App.Microbiol.Biotechnol.2004(70),2529-2534和Shin等(Biosc.Biotechnol.Biochem.2001(65),1782-1788))。特別地，全部所述的R-選擇性ω-轉(zhuǎn)氨酶均通過富集培養(yǎng)獲得。此種方法耗時，這是因為對于有效的方法，通常優(yōu)選在諸如大腸桿菌(Escherichia coli)等異源生物體中過表達(dá)酶。這需要從野生型生物體中分離基因序列，但DNA序列的克隆不總能成功并且是極為耗時的過程。