[發明專利]表面離子共振技術檢測禽法氏囊病毒的非診斷性方法

在審

• 申請號: 201410649854.2
• 申請日: 2014-11-14
• 公開（公告）號: CN104297215A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發明（設計）人: 孫濤;曹丙蕾;孫明君;徐彪;房保海;王群
• 申請（專利權）人: 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: G01N21/552
• 分類號: G01N21/552
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 褚慶森

技術領域

本發明涉及一種表面離子共振技術檢測禽法氏囊病毒的非診斷性方法，屬于生物技術檢測領域。

背景技術

雞傳染性法氏囊病是由傳染性法氏羹病毒(Infectious?Bursal?Disease?Virus，IBDV)引起的一種急性、接觸傳染性疾病。以法氏囊發炎、壞死、萎縮和法氏囊內淋巴細胞嚴重受損為特征，從而引起雞的免疫機能障礙，干擾各種疫苗的免疫效果。目前本病作為危害養禽業的三大主要疫病之一，呈世界性分布，該病引起雛雞的免疫抑制，使病雞對大腸桿菌、腺病毒、沙門氏菌、雞球蟲等病原更易感，對馬立克疫苗、禽法氏囊病毒疫苗等接種的反應能力下降，發病率高，幾乎達100％，死亡率一般為5％～15％，但現在流行的通過變異產生的的超強毒株死亡率達到60％-100％，是當前養禽業最重要的疾病之一。

目前用于監控IBDV的常用方法免疫學方法如瓊脂擴散試驗、病毒中和試驗、免疫組化、酶聯免疫吸附試驗等方法，存在耗時長、操作繁瑣、靈敏度和特異性差的缺點，且均不能實時監測生物大分子之間的相互作用，動態觀察大分子之間結合與解離的平衡關系，較為準確地測定分子間相互作用的親和力。目前已成為篩選各類抗體建立免疫學反應的瓶頸和關鍵。同時傳統的免疫血清學診斷方法大多需要標記各類抗體，無法在大規模推廣應用前實現對抗體或參考抗原的篩選工作，因而需要研究一種相對廉價，并能夠對法氏囊病毒的血清學診斷方法在建立推廣之前進行高通量快速篩選、準確鑒別的集成化診斷技術。

表面等離子體共振技術(SPR)是利用在金屬膜/液面界面，由光的全反射引起的物理光學現象來分析分子間相互作用的技術。SPR儀由自動采樣機械手、高分辨率的CCD照相儀和上面布有一個或多個流池的鍍金或鍍銀SPR生物傳感器芯片構成。SPR技術在檢測、分析生物分子間的相互作用等方面得到廣泛的應用。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是：提供一種利用表面等離子體共振技術來檢測禽法氏囊病毒的方法，同時，所述的方法也可快速篩選一株適配的新城疫單克隆抗體。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：表面離子共振技術檢測禽法氏囊病毒的非診斷性方法，包括下列步驟：

(1)鼠抗抗體的偶聯：鼠抗抗體與表面離子共振系統中的生物傳感器芯片偶聯；

(2)禽法氏囊單克隆抗體的捕獲及捕獲濃度的確定；

(3)樣品的檢測：將待測樣品流過表面離子共振系統中的生物傳感器芯片的流池，測定混合物流過芯片之前和之后相應流池的信號差值，根據上述信號差值確定所述病毒是否存在及其含量。

具體的，上述步驟具體為：

鼠抗抗體與表面離子共振系統中的生物傳感器芯片偶聯的具體步驟為：在室溫20-25攝氏度條件下，將試劑放在樣品架上，設定加樣流速為10μL/min，以inject方式進樣，順次用110μLNHS/EDC混合液活化芯片表面，再加入過量的鼠抗抗體偶聯在活化后的芯片表面上，偶聯完畢后用60μL?Ethanolamine?HCl封閉，使過量的反應基團失活；分析偶聯效果時，通過在開始注射鼠抗抗體前放置一個基線報道點，并在注射Ethanolamine?HCl結束后放置第二個報道點，如信號差在1000-5000RU，則結合鼠抗的水平良好。通常芯片偶聯抗體后可進行100次左右的結合及再生實驗。

法氏囊單克隆抗體與步驟(1)中的鼠抗抗體結合的具體步驟為：準備0.1-0.5μg/ml的含法氏囊單克隆抗體的腹水樣品和0.5μM的法氏囊重組蛋白抗原，經0.22μm的微孔過濾備用。在配體通道上嘗試進樣10μL單抗腹水樣品。然后同時在空白參比通道和配體通道上進樣3min抗原，解離5min，設定流速為10μL/min。為最大限度降低背景值，應控制捕獲單抗后抗原檢測的RU信號差值處在30～50RU的合理區間，以此確定為合適的單抗捕獲濃度，后續的樣品檢測均以此捕獲濃度的單抗進樣。最后用pH3.0的緩沖液10mM?Glycine?HCl進行再生。

檢測樣品的具體步驟為：待檢抗原經0.22μm的微孔過濾備用。設定流速為10μL/min，在相應的的配體通道上進樣10μL確定好濃度的法氏囊單抗。分別注射25μL的HBS緩沖液(作為陰性對照)和待檢抗原，順次進樣與單抗結合，并限定120s解離時間，最后用pH3.0的緩沖液10mM?Glycine?HCl進行再生。通過在開始注射單抗后放置一個基線報道點，并在注射待檢樣品后放置第二個報道點。陰性對照無任何差值，陽性樣品信號有差值，以此確定有禽法氏囊病毒的存在。

優選的，生物傳感器芯片為CM5芯片。