[發明專利]表面離子共振技術檢測禽法氏囊病毒的非診斷性方法

在審

• 申請號: 201410649854.2
• 申請日: 2014-11-14
• 公開（公告）號: CN104297215A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發明（設計）人: 孫濤;曹丙蕾;孫明君;徐彪;房保海;王群
• 申請（專利權）人: 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: G01N21/552
• 分類號: G01N21/552
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 褚慶森

1.??表面離子共振技術檢測禽法氏囊病毒的非診斷性方法，其特征在于，包括下列步驟：

（1）鼠抗抗體的偶聯：鼠抗抗體與表面離子共振系統中的生物傳感器芯片偶聯；

（2）禽法氏囊單克隆抗體的捕獲及捕獲濃度的確定；

（3）樣品的檢測：將待測樣品流過表面離子共振系統中的生物傳感器芯片的流池，測定混合物流過芯片之前和之后相應流池的信號差值，根據上述信號差值確定所述病毒是否存在及其含量。

2.??根據權利要求1所述的方法，其特征在于，具體包括下列步驟：

（1）鼠抗抗體的偶聯：

（a）樣品無需預處理，利用HBS作為緩沖液，設定偶聯引導模式：在Surface?Preparation窗口中，同時選擇Immobilisation和芯片Sensor?Chip:?CM5及Amine?Coupling方法，同時設置不偶聯鼠抗抗體的空白參比通道；

（b）將所有試劑平衡到室溫20-25℃，設定加樣流速為10μL/min；

（c）以inject方式進樣，順次用110μLNHS/EDC混合液活化芯片表面，再加入過量的鼠抗抗體偶聯在活化后的芯片表面上，偶聯完畢后用60μL?Ethanolamine?HCl封閉，使過量的反應基團失活；

（d）分析偶聯效果：通過在開始注射鼠抗抗體前放置一個基線報道點，并在注射Ethanolamine?HCl結束后放置第二個報道點，如信號差達到1000-5000RU，則結合鼠抗的水平良好；

（2）新城疫單克隆抗體的捕獲及適當捕獲濃度的確定：

（a）將0.1~0.5μg/ml的含新城疫單克隆抗體的腹水樣品和100~1000nM的新城疫重組蛋白抗原，經0.22μm的微孔過濾備用；

（b）在配體通道上進樣10μL單抗腹水樣品，然后同時在空白參比通道和配體通道上進樣3min抗原，解離5min，設定流速為10μL/min；

（c）控制捕獲單抗后抗原檢測的RU信號差值處在30~50RU之間，以此確定為合適的單抗捕獲濃度，后續的樣品檢測均以此捕獲濃度的單抗進樣；最后用pH3.0的緩沖液10mM?Glycine?HCl進行再生，去除新城疫單克隆抗體；

（3）樣品的檢測

（a）待檢抗原經0.22μm的微孔過濾備用；

（b）在相應的預要捕獲新城疫單克隆抗體的配體通道上進樣，設定流速為10μL/min，進樣10μL確定好濃度的新城疫單克隆抗體；

（c）分別注射25μL的HBS緩沖液作為陰性對照和待檢抗原，順次進樣與新城疫單克隆抗體結合，并限定120s解離時間，最后用pH3.0的緩沖液10mM?Glycine?HCl進行再生；

（d）通過在開始注射新城疫單克隆抗體后放置一個基線報道點，并在注射待檢樣品后放置第二個報道點，陰性對照無任何差值，陽性樣品信號有差值，以此確定有新城疫病毒的存在。

3.??根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，生物傳感器芯片為CM5芯片。