[發(fā)明專利]一種鴨甲肝病毒VP1蛋白抗原域的重組蛋白的制備方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410649817.1
• 申請日: 2014-11-14
• 公開（公告）號: CN104357462A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫濤;李傳峰;孫明君;王群;鄭小龍
• 申請（專利權(quán)）人: 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心
• 主分類號: C12N15/51
• 分類號: C12N15/51;C12N15/70;C07K14/10;C07K16/10;G01N33/68;G01N33/569
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務(wù)所 37218
• 代理人: 褚慶森

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種鴨甲肝病毒VP1蛋白抗原域的重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

鴨病毒性肝炎(Duck?viral?hepatitis，?DVH)?是由鴨甲肝病毒(Duck?hepatitis?A?virus，?DHAV?)和/或鴨星狀病毒(Duck?astrovirus，?DAstV)引起的一種傳播迅速和高度致死性雛鴨傳染病。該病以肝臟腫大和出血為主要病理特征，主要侵害3周齡以內(nèi)的雛鴨，1周齡以內(nèi)雛鴨致死率高達90%以上，嚴重制約了現(xiàn)代化養(yǎng)鴨產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。該病最早于1945年發(fā)現(xiàn)于美國，隨后在世界許多國家相繼報道，呈現(xiàn)世界性分布。國內(nèi)，黃均建于1963年首次報道了DVH的發(fā)生和流行。為防止境外DVH傳入中國，農(nóng)業(yè)部和國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局把該病列入了最新版《中華人民共和國進境動物檢疫疫病名錄》。

與DAstV比較而言，DHAV是DVH的主要病原，相關(guān)的研究資料也更為詳實。DHAV主要包括血清1、2和3型，分別對應(yīng)DHAV?3個不同基因型：A、B和C型。血清1型DHAV，也即傳統(tǒng)的血清I型鴨肝炎病毒，在中國乃至世界上仍為最主要的流行血清型。血清1型DHAV基因組僅包含1個6750bp的開放閱讀框?(Open?reading?frame，?ORF)，?編碼一條2249aa的多聚蛋白前體，并最終經(jīng)過蛋白酶水解加工形成3個結(jié)構(gòu)蛋白(VP0/VP3/VP1?)和9個非結(jié)構(gòu)蛋白(2A1/2A2/2A3/2B/2C/3A/3B/3C/3D)。其中，VP1基因全長714bp，編碼238個aa的多肽。在小RNA病毒中，VP1蛋白是主要的宿主保護蛋白，其編碼的蛋白包含了主要的抗原位點并具有主要的型特異性中和位點，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護性的中和抗體。因此，VP1蛋白成為近年來的研究熱點。根據(jù)已有文獻資料顯示，完整的VP1蛋白在大腸桿菌表達量普遍偏低，有的毒株甚至不表達。表達菌篩選、表達條件的優(yōu)化以及密碼子改造等在提高目的蛋白的表達量上具有一定的作用。此外，大量研究證明通過選取蛋白主要主要抗原域進行原核表達，蛋白表達量會顯著提高，抗原性保留較好而成本明顯降低。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種鴨甲肝病毒VP1蛋白抗原域的重組蛋白的制備方法。在制備重組蛋白之前，需要進行DHAV?VP1蛋白主要抗原域的預(yù)測，具體步驟如下：

首先將DHAV?A66株?VP1基因的序列翻譯成氨基酸序列，然后應(yīng)用DNAStar?Protean軟件模塊進行二級結(jié)構(gòu)和抗原域預(yù)測，分別用Chou-Fasman法和Garnier-Robson法分析VP1?蛋白的二級結(jié)構(gòu)（α螺旋、β折疊、轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲），并結(jié)合Karplus-Schultz法預(yù)測VP1蛋白骨架區(qū)的柔韌性；采用Kyte-Doolittle法預(yù)測VP1蛋白的親水區(qū)和疏水區(qū)；用Emini原則預(yù)測特定區(qū)域位于蛋白質(zhì)表面的可能性；綜合應(yīng)用二級結(jié)構(gòu)、柔韌性、親水性和表面可能性4種參數(shù)并結(jié)合Jameson-wolf法預(yù)測的VP1蛋白的抗原指數(shù)來確定主要的抗原域（Main?antigenic?domain，?MAD），并命名為VP1M。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種鴨甲肝病毒VP1蛋白抗原域的重組蛋白的制備方法，包括下列步驟：

（1）鴨甲肝病毒VP1蛋白抗原域的特異性引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中登錄的DHAV?A66株全基因序列（GenBank登錄號:?DQ886445）以及預(yù)測的主要抗原域VP1M，本發(fā)明設(shè)計的引物序列如下：

上游引物VP1M-F:?5'–CGGAATTCACACCACTCAGGCCAACTC–3'；

?下游引物VP1M-R:?5'–CCGCTCGAGTTCAATTTCCAGATCGAGTTC–3'，下劃線部分分別為添加的EcoR?I?和Xho?I酶切位點。

（2）RT-PCR擴增和重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建