[發(fā)明專利]一種鴨甲肝病毒VP1蛋白抗原域的重組蛋白的制備方法及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410649817.1
• 申請(qǐng)日: 2014-11-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104357462A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-02-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫濤;李傳峰;孫明君;王群;鄭小龍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
• 主分類號(hào): C12N15/51
• 分類號(hào): C12N15/51;C12N15/70;C07K14/10;C07K16/10;G01N33/68;G01N33/569
• 代理公司: 濟(jì)南泉城專利商標(biāo)事務(wù)所 37218
• 代理人: 褚慶森

1.?一種鴨甲肝病毒VP1蛋白抗原域的重組蛋白的制備方法，其特征在于，包括下列步驟：

（1）鴨甲肝病毒VP1蛋白抗原域的特異性引物引物設(shè)計(jì)與合成：

上游引物VP1M-F:?5'–CGGAATTCACACCACTCAGGCCAACTC–3'；

下游引物VP1M-R:?5'–CCGCTCGAGTTCAATTTCCAGATCGAGTTC–3'，下劃線部分分別為添加的EcoR?I?和Xho?I酶切位點(diǎn)；

（2）RT-PCR擴(kuò)增和重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建；

（3）重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的鑒定；

（4）表達(dá)產(chǎn)物的純化和Western?blot活性檢測(cè)；

根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨甲肝病毒VP1蛋白抗原域的重組蛋白的制備方法，其特征在于，RT-PCR擴(kuò)增和重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建的具體步驟為：

根據(jù)Trizol試劑的使用說(shuō)明提取200μL?DHAV?鴨胚尿囊毒中的總RNA；以提取的總RNA和隨機(jī)引物N6或VP1M-R進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA作為PCR模板；反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?2℃反應(yīng)60min，95℃反應(yīng)5min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶；PCR反應(yīng)采用50μL反應(yīng)體系：cDNA模板?4μL，上下游引物(VP1M-F和VP1M-R)?各2.5μL，2×Pfu?PCR?MasterMix?25μL，ddH₂O?16μL；反應(yīng)條件：95℃?5min；94℃?30s，52℃?30s，72℃?30s，35個(gè)循環(huán)；72℃?10min；反應(yīng)結(jié)束后取6μL?PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析；分析正確后，其剩余PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收；

????將回收的PCR產(chǎn)物與載體pGEX-4T-1分別用EcoR?I和Xho?I雙酶切，回收純化，用T4?DNA?連接酶于16℃連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans?DH5α感受態(tài)細(xì)胞；挑取單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定正確后測(cè)序進(jìn)一步確證，獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pGEX-4T-VP1M。

2.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨甲肝病毒VP1蛋白抗原域的重組蛋白的制備方法，其特征在于，重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的鑒定的具體步驟為：

誘導(dǎo)表達(dá)：將pGEX-4T-VP1M質(zhì)粒和pGEX-4T-1空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞；挑取單個(gè)克隆接入4mL含有100μg/mL氨芐青霉素(Amp)的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，于37℃?220?r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；然后將培養(yǎng)物以1：100的比例接種到100μg/mL的新鮮Amp?LB?液體培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)至菌液D_600nm值達(dá)到0.4~0.8；

表達(dá)產(chǎn)物的鑒定：超聲破碎細(xì)胞，12000g離心15min，分別收集上清及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。

3.?根據(jù)權(quán)利要求3所述的鴨甲肝病毒VP1蛋白抗原域的重組蛋白的制備方法，其特征在于誘導(dǎo)表達(dá)的條件為：誘導(dǎo)溫度為37℃，IPTG誘導(dǎo)濃度為1.0?mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為4h。

4.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨甲肝病毒VP1蛋白抗原域的重組蛋白的制備方法，其特征在于，表達(dá)產(chǎn)物的純化和Western?blot活性檢測(cè)的具體步驟為：

包涵體蛋白的純化參照分子克隆第三版使用包涵體蛋白的分離方法進(jìn)行；純化的目的蛋白濃度用BCA法測(cè)定：取純化的目的蛋白與pGEX-4T-1空載體誘導(dǎo)表達(dá)菌經(jīng)變性處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂乳4℃封閉過(guò)夜后與兔抗DHAV高免血清37℃反應(yīng)2h，PBST洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG?37℃作用2h，洗滌后，在3’-二氨基聯(lián)苯胺緩沖液(DAB)中進(jìn)行顯色。

5.?上述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的鴨甲肝病毒VP1蛋白抗原域的重組蛋白在檢測(cè)鴨甲肝病毒上的應(yīng)用。

6.?上述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的鴨甲肝病毒VP1蛋白抗原域的重組蛋白在制備鴨甲肝病毒抗體上的應(yīng)用。