[發明專利]一種基于SRAP標記的亞麻雜交種種子純度鑒定的方法

在審

• 申請號: 201410648783.4
• 申請日: 2014-11-14
• 公開（公告）號: CN104611415A
• 公開（公告）日: 2015-05-13
• 發明（設計）人: 張建平;黨占海;李聞娟;王利民;黨照;趙瑋;趙利
• 申請（專利權）人: 甘肅省農業科學院作物研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京挺立專利事務所(普通合伙) 11265
• 代理人: 王震秀

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種基于SRAP標記的亞麻雜交種種子純度鑒定的方法。

背景技術

亞麻屬于亞麻科一年生草本植物，是重要的纖維作物和油料作物。亞麻為自花授粉作物，雄性不育系是雜優利用的關鍵。1998年，我國發現了具有溫光敏特性、隱性遺傳的核雄性不育系，利用溫敏特性和隱性遺傳特性，可以實現不育性的保持和恢復，并且容易配制組合，在亞麻雜種優勢利用上顯示了巨大的應用價值(黨占海,張建平,佘新城.溫敏型雄性不育亞麻的研究[J].作物學報,2002,28(6):861～864)，并相繼選育成功了世界首批胡麻雜交種隴亞雜1號，隴亞雜2號等胡麻雜交種。

目前，鑒定亞麻雜交種純度主要依靠田間種植檢測法。雖然傳統的田間形態學鑒定仍是目前最為普遍使用的品種真實性和種子純度鑒定方法，但由于其受環境和基因顯隱性等的影響頗大，人們對其可靠性已產生了置疑。特別在種子貿易仲裁檢驗中，對不發芽的種子和形態相近的材料，僅靠傳統鑒定的方法是很難提供可靠證據的。

隨著生物技術的發展及其在作物育種中應用的不斷深入，科學家們提出了應用分子標記技術進行農作物品種的遺傳和真實性鑒定?；贒NA基礎的分子標記不受環境限制和影響、無表型效應，具有客觀、穩定、快速、高效等特點，因此，分子標記技術在雜交種純度檢測中得到了快速應用。

近年來關于分子標記在種子純度檢測中的應用已有很多，例如西瓜、瓠瓜、花生等作物的運用，但是，尚未見應用分子標記進行亞麻雜交種種子純度檢驗報道。SRAP(Sequence—related?amplified?polymorphism)，相關序列擴增多態性，是一種新型的基于PCR的標記系統，由美國加州大學蔬菜作物系Li與Quiros于2001年提出，SRAP的原理是利用獨特的引物設計對ORFs(open?reading?frames)進行擴增，上游引物長17?bp，5’端的前10?bp是一段填充序列，緊接著是CCGG，?它們組成核心序列及3’端3個選擇堿基，對外顯子進行特異擴增。下游引物長18?bp，5’端的前10～11?bp是一段填充序列，緊接著是AATT，它們組成核心序列及3’端3個選擇堿基，對內含子區域、啟動子域進行特異擴增，因個體不同以及物種的內含子、啟動子與間隔長度不等而產生多態性。SRAP操作簡便，使用長17-18?bp的引物以及50℃的退火溫度，保證了結果的穩定性。通過改變SRAP引物3’端3個選擇堿基可得到更多的引物，由于上游與下游引物可自由組配，因此用少數的引物可進行多種組合，大大減少了合成引物的費用，同時也提高了引物的使用率。SRAP操作簡便、擴增結果穩定、高效、重復性好等優點，已經被應用于圖譜構建、比較基因組學、遺傳多樣性分析和標定基因的研究中。

迄今為止，尚未見應用SRAP標記成功進行亞麻雜交種種子純度檢驗的報道。

發明內容

本發明的目的在于公開了一種基于SRAP標記的亞麻雜交種種子純度鑒定的方法。

為了實現上述目的，本發明提供的技術方案為：一種基于SRAP標記的亞麻雜交種種子純度鑒定的方法，包括以下步驟：

1)提取亞麻總基因組DNA；

2)利用SRAP引物組合M10/E3，以“隴雜1號”基因組DNA為模板進行PCR擴增，或利用SRAP引物組合M2/E5，以“隴雜2號”基因組DNA為模板進行PCR擴增；

3)將擴增后的DNA片段，利用2％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測SRAP擴增產物；?

4)對電泳結果進行分析，將同時具有雙親特異性標記條帶的單株判定為真正的雜交種，計算種子遺傳純度，計算方法為，通過計算供試種子樣品中雜交種數量占總樣品數量的比例確定種子純度。

進一步的，上述的一種基于SRAP標記的亞麻雜交種種子純度鑒定的方法，所述SRAP引物組合M10/E3序列為：

正向引物M10：SEQ?ID?No.1；

反向引物E3：SEQ?ID?No.2；

所述SRAP引物組合M2/E5序列為：

正向引物M2：SEQ?ID?No.3；

反向引物E5：SEQ?ID?No.4。