[發(fā)明專利]一種電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器、其制備方法及其用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410647639.9
• 申請日: 2014-11-17
• 公開（公告）號: CN104374765A
• 公開（公告）日: 2015-02-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳丹;魏琴;胡麗華;龐雪輝;馬洪敏
• 申請（專利權(quán)）人: 濟南大學(xué)
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.?一種電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器的制備方法，所述電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器包括：工作電極、參比電極和對電極，所述工作電極的基底電極為玻碳電極，其表面依次修飾金摻雜的石墨烯、捕獲探針與凝血酶適配體的混合溶液、巰基己醇(MCH)、含0.15?U/μL?RecJ_f的凝血酶、NH₂-DNA1和NH₂-DNA2的混合溶液和Eu(III)-多壁碳納米管(MWCNTs)，所述參比電極為Ag/AgCl電極，對電極為鉑絲電極，所述捕獲探針為5'-SH-(CH₂)₆-AAT?TGG?AGT?CAC?CCC?AAC?CTG?CCC?TAC?CAC?GGA?CT-3'，凝血酶適配體為5'-AAA?AGT?CCG?TGG?TAG?GGC?AGG?TGG?GGG?TGA?CT-(CH₂)₆-3'?，所述NH₂-DNA1片段序列為5'-NH₂-(CH₂)₆-AGT?CAC?CCC?AAC?CTG?CCC?TAC?CAC?GGA?CTT?GAA?ACA?GTC?CGT?GGT?AGG?GCA?GGT?TGG?GGT?GAC?TCC?AAT?T-(CH₂)₆-NH₂-3'，?NH₂-DNA2片段序列為5'-NH₂-(CH₂)₆-GTT?TCA?AGT?CCG?TGG?TAG?GGC?AGG?TTG?GGG?TGA?CTA?ATT?GGA?GTC?ACC?CCA?ACC?TGC?CCT?ACC?ACG?GAC?T-(CH₂)₆-NH₂-3'；

其特征在于，所述制備方法包括以下步驟：

a、合成Eu(III)-MWCNTs納米材料；

b、制備電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器工作電極；

c、制作電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器工作曲線；

其中，步驟a合成Eu(III)-MWCNTs納米材料的具體步驟如下：

①?稀土配合物Eu(TTA)₃的合成：將含有1.0?mol/L?KOH的乙醇溶液和五水硝酸銪混合，然后加入15?mL的乙醇和2-噻吩甲酰三氟丙酮?(與五水硝酸銪的物質(zhì)的量之比3:1)，混合溶液在攪拌下加熱至60?℃反應(yīng)6?h，冷卻至室溫后加水繼續(xù)攪拌30?min，得到的固體用乙醇重結(jié)晶，經(jīng)空氣中干燥后放于五氧化二磷干燥器中干燥24?h即得到白色的稀土配合物Eu(TTA)₃；?

②?Eu(III)-MWCNTs的合成：將羧基化的多壁碳納米管、無水二氯甲烷(DCM)和草酰氯（體積比為40:1）混合后在室溫下攪拌12?h，通過減壓蒸餾去除DCM后得到酰氯功能化的MWCNTs并真空干燥2?h，將上述得到的酰氯功能化的MWCNTs重新分散在20?mL?DCM中，超聲10?min，然后加入含有6,6-二氨基-2,2-聯(lián)吡啶(與羧基化的多壁碳納米管的質(zhì)量之比為3:1)的10mL?DCM，混合物在室溫下攪拌24?h，過濾，并用15?mL的DCM沖洗3次，真空干燥后得到稀土配合物修飾的多壁碳納米管，稱取稀土配合物修飾的多壁碳納米管，上述步驟①制備的Eu(TAA)₃(質(zhì)量之比為1:2)和10?mL?DCM混合，在室溫下攪拌28?h后過濾，用150?mL?DCM洗滌，真空干燥后得到Eu(III)-MWCNTs；

步驟b制備電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器工作電極的具體步驟如下：

①?將玻碳電極表面進行拋光處理使其表面光潔；

②?配制濃度為1?mg/mL的金摻雜的石墨烯溶液，然后將金摻雜的石墨烯溶液滴到電極上，室溫晾干；

③?將捕獲探針與凝血酶適配體混合溶液滴到電極表面，4?℃?孵化12?h；

④?再在電極表面修飾2?mmol/L的MCH溶液以消除電極的非特異性活性位點，用pH為7.4的PBS溶液對電極進行清洗，晾干后，滴上一系列不同濃度的凝血酶（含0.15?U/μL?RecJ_f）溶液，放置40?min；

⑤?將NH₂-DNA1和NH₂-DNA2的混合溶液修飾到電極上，放置1h；

⑥?EDC和NHS?(50?mmol/L)?加入到1.5?mg/mL?Eu(III)-MWCNTs中得到混合溶液并將其滴到電極上，放置2?h，即得到電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器的工作電極；

步驟c制作電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器工作曲線的具體步驟如下：

①?將參比電極—Ag/AgCl電極、對電極—鉑絲電極和上述制備的工作電極，連接在化學(xué)發(fā)光檢測儀的暗盒中，將電化學(xué)工作站和化學(xué)發(fā)光檢測儀連接在一起，光電倍增光的高壓設(shè)置為800?V，掃描電壓設(shè)置為-2.0～0?V；?

②?pH?7.4的PBS緩沖溶液(含0.10?mol/L的K₂S₂O₈)作為底液，通過電化學(xué)發(fā)光法檢測不同濃度的凝血酶產(chǎn)生的電化學(xué)發(fā)光信號強度；根據(jù)所得的電化學(xué)發(fā)光強度與凝血酶濃度的線性關(guān)系，繪制工作曲線。

2.如權(quán)利要求1所述的電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器在測定凝血酶中的用途。