[發明專利]一種家蠶核型多角體病毒免疫膠體金試紙條及檢測方法

有效

• 申請號: 201410646786.4
• 申請日: 2014-11-14
• 公開（公告）號: CN104459120A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 周陽;施海峰;高力;劉海濤;夏恒傳;劉曉勇;姚勤
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/577
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種檢測家蠶核型多角體病毒的免疫膠體金試紙條，其特征在于，所述免疫膠體金試紙條

包括：標記抗原BmNPV-Lef4抗體的膠體金墊和包被的硝酸纖維膜，其中硝酸纖維膜上部檢測線包被兔抗BmNPV-Lef4，硝酸纖維膜下部的質控線包被羊抗鼠IgG。

2.根據權利要求1所述的一種檢測家蠶核型多角體病毒的免疫膠體金試紙條，其特征在于，

其中所述兔抗BmNPV-Lef4的濃度為1～2mg/mL，羊抗鼠IgG濃度為0.5～1mg/mL。

3.一種家蠶核型多角體病毒的快速檢測方法，其特征在于，所述的檢測方法采用檢測家蠶核

型多角體病毒的免疫膠體金試紙條，具體操作如下：

檢測樣品的采集：稱取家蠶組織置于PBS緩沖液中，

進行研磨勻漿；然后，離心，用吸管吸取上清液；或直接吸取家蠶血淋巴置于離心管中待用；

取2～3滴步驟（1）中的上清液或血淋巴，滴到樣品孔（S孔）中，等待2～5min

后即可觀察結果；如分別在C（質控線）和T（檢測線）處出現沉淀線，表明樣品為BmNPV陽性；如果僅有C線出現，表明樣品為BmNPV陰性；如果沒有條帶出現，表明該膠體金檢測試紙條為不合格品。

4.?根據權利要求3所述的一種家蠶核型多角體病毒的快速檢測方法，其特征在于，步驟（1）中家蠶組織與PBS緩沖液的比例為20～50mg：150～250μL。

5.?如權利要求1或3所述檢測家蠶核型多角體病毒的免疫膠體金試紙條的制備方法，其特征在于，按照以下步驟進行：

（1）首先選擇家蠶核型多角體病毒高度保守的早期核心基因Lef4進行克隆、表達和純化，獲得外源蛋白BmNPV-Lef4；

（2）制備BmNPV-Lef4抗原的多克隆抗體：

以純化的蛋白BmNPV-Lef4為抗原，弗氏佐劑為乳化劑，按照常規方法免疫新西蘭大白兔，制備BmNPV-Lef4的抗血清；再利用Protein?A抗體純化試劑盒進行純化，獲得BmNPV-Lef4的多克隆抗體，置于-80℃保存待用；

（3）制備小鼠腹水抗體，即鼠抗家蠶核型多角體病毒單克隆抗體：

以純化的蛋白BmNPV-Lef4為抗原免疫BALB/c小鼠，制備篩選單克隆抗體；?

（4）制備BmNPV免疫膠體金檢測試紙條：

A.?標記抗原BmNPV-Lef4抗體的膠體金墊制備：采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，制備完成后將步驟（3）中制備的鼠抗家蠶核型多角體病毒單克隆抗體加入膠體金，邊加邊攪拌后，室溫放置；在溶液中加入BSA，混勻，離心；去上清，將制備的膠體金標記抗體鋪在玻璃纖維膜上，真空干燥，制成膠體金墊；

B．檢測線和質控線抗體的包被：噴膜儀在硝酸纖維膜上部劃線，以兔抗BmNPV-Lef4包被檢測線；以羊抗鼠IgG包被硝酸纖維膜NC膜下部的質控線；

C．試紙組裝：已包被IgG的硝酸纖維素膜、金標墊、玻璃纖維膜即樣品墊和吸水紙按先后順序粘于背板上。

6.?根據權利要求5所述的檢測家蠶核型多角體病毒的免疫膠體金試紙條的制備方法，其特征在于，其中步驟（4）的A中制備的膠體金粒徑為20～50nm的膠體金；室溫放置20min，加入的BSA的濃度為10%，BSA在溶液中的終濃度為1%。

7.?根據權利要求5所述的檢測家蠶核型多角體病毒的免疫膠體金試紙條的制備方法，其特征在于，其中步驟（4）的A中膠體金標記抗體按1mL鋪20cm^2?的比例鋪在玻璃纖維膜上。

8.?根據權利要求5所述的檢測家蠶核型多角體病毒的免疫膠體金試紙條的制備方法，其特征在于，其中步驟（4）的A中每1mL膠體金溶液加入的鼠抗家蠶核型多角體病毒單克隆抗體為15-25μL。

9.?根據權利要求5所述的檢測家蠶核型多角體病毒的免疫膠體金試紙條的制備方法，其特征在于，其中步驟（4）的B中所述的兔抗BmNPV-Lef4濃度為1～2mg/mL，羊抗鼠IgG濃度為0.5～1mg/mL。