[發明專利]一種家蠶核型多角體病毒免疫膠體金試紙條及檢測方法

有效

• 申請號: 201410646786.4
• 申請日: 2014-11-14
• 公開（公告）號: CN104459120A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發明（設計）人: 周陽;施海峰;高力;劉海濤;夏恒傳;劉曉勇;姚勤
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/577
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種家蠶核型多角體病毒免疫膠體金檢測試紙條及檢測方法，具體涉及一種免疫層析技術檢測家蠶核型多角體病毒的免疫膠體金診斷試紙條及其制備方法，屬于病毒疫病診斷技術領域。?

背景技術

家蠶是重要的經濟昆蟲，所產蠶絲是絲綢原料的主要來源，在人類經濟生活與歷史文化中均具有重要的地位。然而高發的蠶病直接影響蠶繭的產量及質量，制約了養蠶業的健康和持續發展。蠶病分傳染性蠶病和非傳染性蠶病，以傳染性蠶病危害為重。常見的傳染性蠶病主要是僵病、膿病、軟化病等三種。這些病的共同特點是潛伏期長、發病快、來勢猛、范圍廣、危害性大，一般會導致減產10～20%，嚴重時高達80～90%，甚至顆粒無收，給蠶農帶來極大的損失。而家蠶核型多角體病毒(Bombyx?mori?NuclearPolyhedrosisVirus，BmNPV）病是養蠶生產上最常見的、危害最嚴重的一類蠶病，家蠶患此病的后期常流出膿汁，內含大量的多角體病毒，俗稱膿病。

目前在實際工作中用于檢測該病毒的檢測試劑盒幾乎未見，而實驗室常采用的檢測技術也多為常規PCR檢測，而PCR檢測方法存在用時太長、成本高、操作復雜以及不易臨場即時檢測等多種問題。與之相比，免疫膠體金技術(Immune?colloidal?gold?technique，ICG)作為一種以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體反應的一種新型的免疫標記技術，是繼三大標記技術（熒光素、放射性同位素和酶）后發展起來的固相標記免疫測定技術，具有多項優點，如操作簡便，不需要花費時間做培訓；整個檢測過程耗時短，生產和使用成本低；免疫膠體金試紙條穩定性好，無需冷藏；檢測對象種類豐富，不僅用于查血、尿等，還用于查細菌、病毒等；適用于基層單位和養殖戶在現場做檢測和診斷。近年來，該技術在醫學、動植物檢疫、食品安全監測等領域得到了廣泛的應用。而到目前為止，該技術在家蠶核型多角體病毒（BmNPV）的檢測中尚未見報道，而且由于家蠶的血淋巴和組織采集方便，特別血淋巴不易凝固，可以直接采集家蠶血淋巴用于膠體金檢測中，可極大地減少操作步驟和使用成本，更便于蠶農和一線技術人員的掌握和使用，因而該診斷膠體金試紙條具有較好的應用前景。

發明內容

?本發明的目的在于彌補現有技術不足，提供一種快速檢測家蠶核型多角體病毒(BmNPV)的免疫膠體金檢測方法，并提供一種用于快速檢測BmNPV的免疫膠體金試紙條。采用本發明的檢測試紙條檢測BmNPV，檢測時間短，成本低，檢測結果特異，結果易判斷，實用性更強，非常適合基層使用。

本發明采取以下技術方案：

一種檢測家蠶核型多角體病毒的免疫膠體金試紙條，其特征在于，所述免疫膠體金試紙條包括：標記抗原BmNPV-Lef4抗體的膠體金墊和包被的硝酸纖維膜，其中硝酸纖維膜上部檢測線包被兔抗BmNPV-Lef4，硝酸纖維膜下部的質控線包被羊抗鼠IgG。

其中兔抗BmNPV-Lef4的濃度為1～2mg/mL，羊抗鼠IgG濃度為0.5～1mg/mL。

本發明還提供一種家蠶核型多角體病毒的快速檢測方法，其特征在于，所述的檢測方法采用檢測家蠶核型多角體病毒的免疫膠體金試紙條，具體操作如下：

（1）????檢測樣品的采集：稱取20～50mg家蠶組織置于150～250μL?PBS緩沖液中，

進行研磨勻漿；然后，3000～5000rpm/min離心2min，用吸管吸取上清液；或直接吸取家蠶血淋巴置于離心管中待用。

（2）滴2～3滴步驟（1）中的上清液或血淋巴，滴到樣品孔（S孔）中，等待2～5min后即可觀察結果。

如分別在C（質控線）和T（檢測線）處出現沉淀線，表明樣品為BmNPV陽性；如果僅有C線出現，表明樣品為BmNPV陰性；如果沒有條帶出現，表明該膠體金檢測試紙條為不合格品。

所述檢測家蠶核型多角體病毒的免疫膠體金試紙條的制備方法，其特征在于，按照以下步驟進行：

1.?首先選擇家蠶核型多角體病毒高度保守的早期核心基因Lef4（GenBank:?AY033655.1）進行克隆、表達和純化，獲得外源蛋白BmNPV-Lef4。

2.?制備BmNPV-Lef4抗原的多克隆抗體：

以純化的蛋白BmNPV-Lef4為抗原，弗氏佐劑為乳化劑，按照常規方法免疫新西蘭大白兔，制備BmNPV-Lef4的抗血清；再利用Protein?A抗體純化試劑盒進行純化，獲得BmNPV-Lef4的多克隆抗體，置于-80℃保存待用。

3.?制備小鼠腹水抗體（單克隆抗體）：