[發(fā)明專利]一種Y染色體標記方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410646040.3
• 申請日: 2014-11-14
• 公開（公告）號: CN104388560A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 戴蘊平;孫照霖;丁方榮;王海萍;李京;李玲
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;陳曉慶

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種Y染色體標記方法及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

性別控制是指通過人為地干預或操作使動物繁殖出特定性別的后代的技術(shù)。哺乳動物性別控制是畜牧研究中的重要內(nèi)容，其研究成果對于動物遺傳育種、疾病防治以及畜牧生產(chǎn)均具有重要意義：其一，可以大大提高畜牧業(yè)的經(jīng)濟效益。畜牧業(yè)生產(chǎn)中不同性別的家畜有不同的用途，因此可運用此技術(shù)提高大量雌性個體如奶牛、母雞的數(shù)量，而且可以節(jié)約雄性個體在繁殖年度的飼料消耗，相反雄性肉牛，綿羊和豬等增重要快，肉質(zhì)也優(yōu)等特點也可通過此技術(shù)控制多產(chǎn)雄性后代。其二，實現(xiàn)動物的性別控制可以消滅不理想的隱性性狀，加速家畜的遺傳進展，加快畜群的更新。

目前性別控制的常用方法主要包括：X，Y精子的分離、胚胎性別的鑒定和環(huán)境控制等方法。

第一，X，Y精子的分離

原理：根據(jù)X，Y精子在物理(體積，密度，電荷，運動性)和化學(DNA含量，表面抗原)等方面的差異，建立對精子進行分選的各種方法，包括沉降法、電泳法、離心法及其目前應(yīng)用比較多的流式細胞分離法、免疫學和FISH技術(shù)鑒定方法。

流式細胞分離法：主要依據(jù)是X、Y精子DNA的含量不同。一般來說，X精子比Y精子含有較多DNA，所以用熒光染料Hoechst33342染色時，X精子吸收的染料多，發(fā)出的熒光也強，就此可以分辨出X與Y精子，然后再利用計算機控制使熒光強的X精子帶上正電荷，Y精子帶上負電荷，在通過高壓電場時便向不同的方向偏轉(zhuǎn)，從而達到分離目的，分辨率可達90％，但用流式細胞分離器分離精子時，精子需要一個個通過，這樣就必須稀釋精液，這就會造成精子的運動能力下降，而且熒光染料對精子有毒害作用，加之效率太低儀器價格昂貴，在授精后還有產(chǎn)仔數(shù)和妊娠率下降的情況，還無法用于生產(chǎn)實踐。

免疫學方法：隨著免疫學的發(fā)展人們發(fā)現(xiàn)在雄性組織包括Y精子，存在有H—Y抗原。雄性組織免疫雌性動物產(chǎn)生H—Y抗體，且只有Y精子才能表達H—Y抗原，因而利用H—Y抗體檢測精子質(zhì)膜上存在的H—Y抗原，再通過免疫或分離方法獲得X、Y精子。1982年，研究者Zavos把H—Y抗血清注入母兔陰道內(nèi)，15分鐘后輸精，所產(chǎn)生的雌性兔占74.2％。H—Y抗血清是利用免疫雌性動物后而獲取的，但H—Y抗原自身是一種弱抗原，加之動物個體自身對免疫反應(yīng)的差異，很難起到較好的免疫效果，而且分離精子活力下降也會影響受胎率和產(chǎn)仔數(shù)。目前國內(nèi)外對H—Y克隆抗體都有廣泛的研究，可以期望未來免疫學方法能在控制性別上得到應(yīng)用。

FISH技術(shù)鑒定法：熒光原位雜交技術(shù)(是一種利用非放射性的熒光信號對原位雜交樣本進行檢測的技術(shù))。FISH由于其直觀，快速，敏感性高和方便靈活越來越得到廣泛的應(yīng)用。基本原理是：將標記了熒光的單鏈DNA(探針)和與其互補的DNA退火雜交，通過觀察熒光信號在染色體上的位置來反映相應(yīng)基因的情況。即利用Y染色體特異核酸探針與精子上的特定的序列雜交，而后標定熒光物質(zhì)，在熒光顯微鏡下直接觀察并區(qū)分X精子和Y精子。該方法特別適用于X精子和Y精子DNA含量差別很微小，重分析不能保證準確性的情況。最初運用FISH在牛精子上的結(jié)果是可清楚鑒定79％的精子。但是該方法的缺陷是耗費時間長，且試劑的價格較高

第二：胚胎性別的鑒定

原理：在胚胎期，利用核型分析法、免疫學法和SRY-PCR鑒定法檢測其雌性還是雄性，從而選著目的性別胚胎進行后續(xù)操作。

核型分析法：通過查明胚胎細胞的性染色體類型為XX型和XY型來鑒定胚胎的性別。操作過程為：取少量的胚胎細胞經(jīng)秋水仙素處理固定染色，檢查性染色體，根據(jù)染色體在細胞分裂中期不同的譜帶和Y染色體的大小形態(tài)來判定性別，這種方法準確率幾乎可達到100％，但操作繁瑣，難以在生產(chǎn)中應(yīng)用。目前主要用來驗證其他性別鑒定方法的準確率。

免疫學法：先將8細胞桑葚胚期的胚胎與H—Y抗體反應(yīng)30min，再與異硫氰酸鹽熒光素(FITC)標記的免疫球蛋白IgM抗體反應(yīng)，然后在熒光顯微鏡下檢查胚胎是否帶有熒光素，若有則判定為H—Y+胚胎，不顯熒光則為H—Y-胚胎。在牛有89％的雌性鑒定準確率，豬有81％的鑒定準確率，綿羊有85％的鑒定準確率。