[發明專利]一種Y染色體標記方法及其應用

有效

• 申請號: 201410646040.3
• 申請日: 2014-11-14
• 公開（公告）號: CN104388560A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發明（設計）人: 戴蘊平;孫照霖;丁方榮;王海萍;李京;李玲
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;陳曉慶

1.一種動物Y染色體標記方法，是利用TALEN方法對離體的動物體細胞的Y染色體進行特異性標記；

所述特異性標記是在Y染色體的性別決定基因SRY上進行標記；

所述標記對其所在的動物的體細胞和生殖細胞不產生危害；

所述標記的基因為自身發光或催化底物顯色的蛋白的編碼基因。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述對離體的動物體細胞的Y染色體進行特異性標記的方法為：使TALE蛋白-Ⅰ和TALE蛋白-Ⅱ在雄性動物A的離體體細胞中表達，得到Y染色體上靶序列發生突變的體細胞；同時將標記基因同源重組到靶序列位置，實現標記基因在雄性動物A的離體體細胞Y染色體上靶序列處的定點整合；

所述TALE蛋白-Ⅰ的氨基酸序列如SEQ?ID?No.3所示；

所述TALE蛋白-Ⅱ的氨基酸序列如SEQ?ID?No.5所示；

所述靶序列如SEQ?ID?No.1所示。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述使TALE蛋白-Ⅰ和TALE蛋白-Ⅱ在雄性動物A的離體體細胞中表達的方法為：將分別含有TALE蛋白-Ⅰ和TALE蛋白-Ⅱ編碼基因的重組表達質粒導入所述雄性動物A的離體體細胞中；

所述TALE蛋白-Ⅰ的編碼基因序列如SEQ?ID?No.2所示；

所述TALE蛋白-Ⅱ的編碼基因序列如SEQ?ID?No.4所示；

所述將標記基因同源重組到靶序列位置的方法為將所述標記基因通過線性化的同源重組載體整合到所述靶序列位置；

所述線性化的同源重組載體上具有靶序列同源左臂-標記基因-靶序列同源右臂的片段。

4.根據權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述靶序列同源左臂的序列如SEQ?ID?No.12中自5’末端起第664位至第1498位核苷酸所示；

所述靶序列同源右臂的序列如SEQ?ID?No.12中自5’末端起第4068位至第4991位核苷酸所示。

5.根據權利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述標記基因為綠色熒光蛋白基因；

所述綠色熒光蛋白基因具體如SEQ?ID?No.12中自5’末端起第1573位至第2271位核苷酸所示；

所述靶序列同源左臂-標記基因-靶序列同源右臂的片段的序列如SEQ?ID?No.12中自5’末端起第664位至第4991位核苷酸所示。

6.根據權利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述同源重組載體的核苷酸序列如SEQ?ID?No.12所示；

所述線性化為限制性內切酶AhdI線性化。

7.一種動物性別的鑒定或選擇方法，是利用權利要求1-6任一所述的方法對雄性動物A的離體體細胞中的Y染色體進行標記，得到帶有標記的轉基因細胞；以轉基因細胞為核供體細胞，通過體細胞克隆技術得到體細胞克隆雄性動物B；在體細胞克隆雄性動物B的后代胚胎中，具有標記的胚胎為雄性胚胎，不具有標記的胚胎為雌性胚胎。

8.一種試劑盒，該試劑盒含有如下1)-4)的至少一種物質：

1)含有SEQ?ID?No.3所示蛋白的編碼基因的DNA分子、重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌；

2)含有SEQ?ID?No.5所示蛋白的編碼基因的DNA分子、重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌；

3)SEQ?ID?No.12所示的DNA分子或含有該分子的轉基因細胞系或重組菌；

4)含有SEQ?ID?No.12中自5’末端起第664位至第4991位核苷酸所示的DNA分子、重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌；

所述SEQ?ID?No.3所示的蛋白的編碼基因具體如SEQ?ID?No.2所示；

所述SEQ?ID?No.5所示的蛋白的編碼基因具體如SEQ?ID?No.4所示。

9.SEQ?ID?No.12所示的DNA分子；

和/或，

含有SEQ?ID?No.12中自5’末端起第664位至第4991位核苷酸所示的DNA分子；

和/或,

SEQ?ID?No.2所示的DNA分子；

和/或,

SEQ?ID?No.4所示的DNA分子。

10.權利要求8所述的試劑盒或權利要求9所述的DNA分子在制備標記動物離體體細胞Y染色體的產品中的應用；

或，

權利要求8所述的試劑盒或權利要求9所述的DNA分子在制備Y染色體上帶有標記的雄性動物的產品中的應用；

或，

權利要求8所述的試劑盒或權利要求9所述的DNA分子在制備Y染色體上帶有標記的雄性動物細胞的產品中的應用；

或，

權利要求8所述的試劑盒或權利要求9所述的DNA分子在制備用于動物性別的鑒定或選擇的產品中的應用；

或，

權利要求8所述的試劑盒或權利要求9所述的DNA分子在動物繁育中的應用。