[發(fā)明專利]大瀧六線魚(yú)卵黃原蛋白間接ELISA試劑盒及其制備方法、檢測(cè)方法及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410644632.1
• 申請(qǐng)日: 2014-11-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104360075A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-02-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王松;王駿;張鐵軍;冷凱良;苗鈞魁;姜勇;羅忻;吳振興
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/68
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/68;G01N33/74
• 代理公司: 濟(jì)南泉城專利商標(biāo)事務(wù)所 37218
• 代理人: 褚慶森

1.一種檢測(cè)大瀧六線魚(yú)卵黃原蛋白的間接ELISA試劑盒，包括一個(gè)盒體，盒體內(nèi)有空白96孔酶標(biāo)板1塊，封閉液、包被液、洗滌液、樣品稀釋液、顯色液、終止液和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗各1支，其特征在于該盒體還裝有：大瀧六線魚(yú)卵黃原蛋白純品1支，兔抗大瀧六線魚(yú)卵黃原蛋白多克隆抗體1支。

2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)大瀧六線魚(yú)卵黃原蛋白的間接ELISA試劑盒，其特征在于：

洗滌液為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)是0.05%?Tween-20的150mM?pH7.4的磷酸鹽緩沖液；

封閉液為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)是2%?BSA的pH7.4的磷酸鹽緩沖液；

樣品稀釋液為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)是0.05%?Tween-20、1%?BSA的150mM?磷酸鹽緩沖液；

顯色液為T(mén)MB單組分顯色液；

終止劑為2M的H₂SO₄水溶液。

3.制備權(quán)利要求1所述的檢測(cè)大瀧六線魚(yú)卵黃原蛋白的間接ELISA試劑盒的方法，其特征在于，包括下列步驟：

1)制備大瀧六線魚(yú)卵黃原蛋白純品；

2)利用步驟1）得到的大瀧六線魚(yú)卵黃原蛋白純品制備兔抗大瀧六線魚(yú)卵黃原蛋白多克隆抗體；

3)將步驟1)得到的大瀧六線魚(yú)卵黃原蛋白純品1支、步驟2)得到的兔抗大瀧六線魚(yú)卵黃原蛋白多克隆抗體1支、以及包被液、封閉液、樣品稀釋液、洗滌液、顯色液、終止液及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗各1支放入盒內(nèi)，得到檢測(cè)大瀧六線魚(yú)卵黃原蛋白的間接ELISA試劑盒。

4.如權(quán)利要求3所述的檢測(cè)大瀧六線魚(yú)卵黃原蛋白的間接ELISA試劑盒的制備方法，其特征在于，所述的大瀧六線魚(yú)卵黃原蛋白純品的制備方法如下：

采用肌肉注射17β-雌二醇(17β-estradiol，E₂)的方式誘導(dǎo)大瀧六線魚(yú)產(chǎn)生卵黃原蛋白；注射一周后取血，4℃，5000?g離心10分鐘，收集上清液；向上清中加入等體積的飽和硫酸銨溶液，冰浴條件下?lián)u晃2小時(shí)后離心，向沉淀中加入pH?7.5的25mM?Tris-HCl?，使沉淀重新溶解；進(jìn)一步的純化采用1.5′20?cm?的Sephadex?G-200層析柱，加入1?ml上述溶液，用pH?7.5的25mM?Tris-HCl洗層析柱，收集第一個(gè)洗脫峰，即為大瀧六線魚(yú)卵黃原蛋白。

5.如權(quán)利要求3所述的檢測(cè)大瀧六線魚(yú)卵黃原蛋白的間接ELISA試劑盒，其特征在于，所述的兔抗大瀧六線魚(yú)卵黃原蛋白多克隆抗體的制備方法如下：

取600?μg純化的大瀧六線魚(yú)卵黃原蛋白，加入等體積的弗氏完全佐劑，對(duì)大白兔進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射，兩周后再次加強(qiáng)免疫，免疫劑量為600μg/只，用弗氏不完全佐劑充分乳化后進(jìn)行背部皮下注射；此后，每隔7天按以上方法進(jìn)行加強(qiáng)免疫；于每5次注射5天后從心臟取血，6000?g離心20分鐘，收集上清，獲得了兔抗大瀧六線魚(yú)卵黃原蛋白多克隆抗血清；向抗血清中加入等體積的PH?7.4?0.02?mol/L磷酸緩沖液；在冰浴條件下加入硫酸銨，至50%飽和度，0℃震蕩2h后，低溫離心，8000?g、15min，棄上清，沉淀用10ml?0.02mol/L磷酸緩沖液溶解；以0.02mol/L磷酸緩沖液透析24h；用0.45微米孔徑的濾膜過(guò)濾后，上Hitrap?Protein?G柱，隨后以0.02?mol/L磷酸緩沖液洗脫10個(gè)柱體積，然后以0.1M甘氨酸(pH2.7)洗脫抗體，即獲得兔抗大瀧六線魚(yú)卵黃原蛋白多克隆抗體。