[發(fā)明專利]脂肪酶的微生物發(fā)酵及提取分離方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410644517.4
• 申請日: 2014-11-14
• 公開（公告）號: CN104388404A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王幼鵬
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽華億農(nóng)牧科技發(fā)展有限公司
• 主分類號: C12N9/20
• 分類號: C12N9/20;C12R1/84
• 代理公司: 安徽合肥華信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 34112
• 代理人: 余成俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種脂肪酶的微生物發(fā)酵及提取分離方法。

背景技術(shù)

脂肪酶(EC3．1．1．3，Lipase)，又稱甘油酯水解酶，是指分解或合成高級脂肪酸和丙三醇形成的甘油三酸酯酯鍵的酶。脂肪酶是一類特殊的酯鍵水解酶，只作用于異相系統(tǒng)，即只在油水界面上作用，而且只有當(dāng)?shù)孜镆晕⒘！⑿【酆戏稚顟B(tài)或呈乳化顆粒時，脂肪酶對底物水解才有顯著的催化作用。脂肪酶廣泛存在動物、植物和微生物中而微生物脂肪酶種類最多，廣泛存在于細(xì)菌、酵母和霉菌中，最易獲得和大規(guī)模生產(chǎn)，且具有比動植物脂肪酶更廣的pH、溫度適應(yīng)性，因此是工業(yè)用脂肪酶的重要來源。

脂肪酶的生產(chǎn)和使用成本是制約其工業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。由于野生菌產(chǎn)脂肪酶的能力低，酶系復(fù)雜，較難分離純化，一般無法直接用于大規(guī)模生產(chǎn)。通過基因工程技術(shù)構(gòu)建合適的表達(dá)系統(tǒng)不僅能夠提高脂肪酶的表達(dá)量，而且可以簡化后續(xù)蛋白質(zhì)的分離純化工藝，從而降低生產(chǎn)成本。另外，制備純化的立體選擇性酶對于立體選擇性反應(yīng)是非常重要的，能夠避免其他非立體選擇性酶的影響。巴斯德畢赤酵母(Pichia?pastoris)是近幾年發(fā)展起來的較為完善的、被廣泛用來表達(dá)外源蛋白的甲醇營養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)。主要優(yōu)點(diǎn)有：（1）?具有強(qiáng)有力的醇氧化酶(Alochol?Oxidase，AOX1)基因啟動子，可嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá)；（2）作為真核表達(dá)系統(tǒng)，可對表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后的加工與修飾，從而使表達(dá)出的蛋白具有生物活性；（3）營養(yǎng)要求低、生長快、培養(yǎng)基廉價(jià)，便于工業(yè)化生產(chǎn)；（4）可高密度發(fā)酵培養(yǎng)，在發(fā)酵罐中細(xì)胞干重甚至可達(dá)120g/L以上；?（5）表達(dá)量高，許多蛋白可達(dá)到g/L以上水平；（6）表達(dá)的蛋白既可存在于細(xì)胞內(nèi)，又可分泌到胞外，自身分泌的蛋白非常少，十分有利于純化；（7）糖基化程度低，所分泌的糖蛋白的免疫原性較低，更利于臨床應(yīng)用。

長期以來，我國的脂肪酶市場都被國外公司所壟斷，且價(jià)格昂貴，因此開發(fā)我國自主創(chuàng)新的脂肪酶及其制劑對于推動我國科技進(jìn)步和實(shí)現(xiàn)國家繁榮富強(qiáng)具有重要的進(jìn)步意義。國內(nèi)關(guān)于脂肪酶的微生物發(fā)酵和提取技術(shù)尚不成熟，脂肪酶制劑在我國現(xiàn)有的酶制劑生產(chǎn)企業(yè)中還沒有一家成規(guī)模的生產(chǎn)企業(yè)，其產(chǎn)品還存在著催化活性低、穩(wěn)定性差、使用壽命短等問題。因此，積極研究開發(fā)脂肪酶及其制劑，有利于打破國外技術(shù)壟斷，實(shí)現(xiàn)脂肪酶向產(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)變和帶動相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，實(shí)現(xiàn)我國的繁榮富強(qiáng)。

發(fā)明內(nèi)容

針對我國現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，本發(fā)明提供了一種脂肪酶的微生物發(fā)酵及提取分離方法，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種脂肪酶的微生物發(fā)酵及提取分離方法，其方法如下：

（1）發(fā)酵菌種

以基因工程菌畢赤酵母GS115?/pPIC9K-proRCL作為發(fā)酵生產(chǎn)菌種；

（2）培養(yǎng)液

a、搖瓶培養(yǎng)液

酵母提取物10?g/L，蛋白胨20?g/L，K₂HPO₄?3g/L，H₂PO₄?11.8g/L，加水890mL/L，121℃滅菌20?min，然后待溫度降至60℃以下在超凈臺上加入10×YNB?100mL/L(13.4?g/L)，500×生物素1mL/L(4×10^-4?g/L)，甘油10mL/L；

b、發(fā)酵培養(yǎng)液

85%?H₃PO₄?26.7mL/L，CaSO₄?·2H₂O?0.93g?/L，K₂SO4?18.2g?/L，MgSO₄·2H₂O?14.9g/L，KOH?4.13?g/L，甘油40g/L，PTM₁?4.0mL/L（其中甘油、PTM₁待實(shí)消結(jié)束后再加入）；

c、PTM₁