[發明專利]脂肪酶的微生物發酵及提取分離方法

在審

• 申請號: 201410644517.4
• 申請日: 2014-11-14
• 公開（公告）號: CN104388404A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發明（設計）人: 王幼鵬
• 申請（專利權）人: 安徽華億農牧科技發展有限公司
• 主分類號: C12N9/20
• 分類號: C12N9/20;C12R1/84
• 代理公司: 安徽合肥華信知識產權代理有限公司 34112
• 代理人: 余成俊

1.一種脂肪酶的微生物發酵及提取分離方法，其特征在于，其方法如下：

（1）發酵菌種

以基因工程菌畢赤酵母GS115?/pPIC9K-proRCL作為發酵生產菌種；

（2）培養液

a、搖瓶培養液

酵母提取物10?g/L，蛋白胨20?g/L，K₂HPO₄?3g/L，H₂PO₄?11.8g/L，加水890mL/L，121℃滅菌20?min，然后待溫度降至60℃以下在超凈臺上加入10×YNB?100mL/L(13.4?g/L)，500×生物素1mL/L(4×10^-4?g/L)，甘油10mL/L；

b、發酵培養液

85%?H₃PO₄?26.7mL/L，CaSO₄?·2H₂O?0.93g?/L，K₂SO4?18.2g?/L，MgSO₄·2H₂O?14.9g/L，KOH?4.13?g/L，甘油40g/L，PTM₁?4.0mL/L（其中甘油、PTM₁待實消結束后再加入）；

c、PTM₁

CuSO₄·5H₂O?6.0g/L，KI?0.088g/L，MnSO₄·H₂O?3.0g/L，Na₂MoO₄·2H₂O?0.2g/L，H₃BO₃?0.02g/L，CoC1₂·6H₂O?0.5g/L，ZnCl₂?20.0g/L，FeSO₄·7H₂O?65.0g/L，生物素0.2?g/L，濃H₂SO₄?5?mL/L；

d、補料培養液

50%甘油(W/V，含12mL/L?PTM₁)補料液；

e、BMMY培養液

酵母提取物10?g/L，蛋白胨20?g/L，K₂HPO₄?3g/L，KH₂PO₄?11.8g/L，加水895mL/L，121℃滅菌20?min，然后待溫度降至60℃以下在超凈臺上加入100×YNB?100mL/L(13.4?g/L)，500×生物素1mL/L(4×10^-4?g/L)，甲醇5m/L；

f、甲醇誘導培養液

100%甲醇（含12mL/L?PTM₁）；

（3）菌種發酵生產

a、挑選一單菌落，置于裝有25ml搖瓶培養液的250ml搖瓶中，于28-30℃/250-300?rpm培養16-18?h；

b、配制發酵培養液（甘油、PTM₁暫不加入）并加入發酵罐內，標定pH電極與DO電極并插入罐體，密封發酵罐，接通蒸汽，對發酵罐的空氣系統及罐體實施滅菌，待罐壓升至0.12MPa，溫度121℃時，保壓、保溫滅菌20min，待實消結束，接通冷凍循環水將溫度冷卻至28-30℃；

c、在接種口周圍放一圈酒精棉球，點燃，在無菌條件下打開接種口，將搖瓶培養液按5-10%接種量迅速接種于發酵罐內，并補加已經過濾除菌的甘油40g/L，PTM₁?4.0mL/L，設定好溫度、攪拌轉速、通氣量等參數，進行發酵，發酵20?h左右，發酵培養液中的甘油被消耗殆盡，此時DO迅速上升到100%，開始流加補料培養液，補料培養液的流加時間為6-24?h，在發酵過程中，保持罐內溫度28-30℃，罐內溶氧DO>20%，罐內pH值5-7，通過調節通氣量和攪拌轉速來控制溶氧的高低，自動流加質量濃度25%的無菌氨水來控制發酵培養液的pH值大小；

d、待補料培養液流加結束，停止補料，維持細胞饑餓0.5-1?h，然后流加BMMY培養液0.5-1?h讓酵母菌適應甲醇環境，當DO再次上升到100%時開始流加甲醇誘導培養液，控制體系中甲醇的質量濃度在0-1h內為1.0-2.0%，在2-4h內為3.0-5.0%，在4-8h內為2.0-3.0%，在8h后為0.5-1.0%，在誘導期間，溫度控制在20-28℃，pH值控制在5.5-6.5，溶氧DO>20%；

e、甲醇誘導培養36-72h后，開始放罐，將發酵液轉移至冷凍離心機中于4℃/1500-3000g離心5-10min，收集離心上清液；

（4）脂肪酶提取分離

a、硫酸銨沉淀

將硫酸銨粉末邊攪拌邊加入到離心上清液中，使硫酸銨終濃度為2%，放于4℃冰箱靜置0.5-1?h，然后于4℃/3000-5000g離心5-10min，收集離心上清液，以同樣的方式再次將硫酸銨粉末加入到離心上清液中，使硫酸銨終濃度為60%，放于4℃冰箱靜置0.5-1?h，然后于4℃/3000-5000g離心5-10min，收集離心沉淀，將離心沉淀用中性磷酸鹽緩沖液溶解，得到粗酶液；

b、凝膠過濾層析

用分離分子量在16-200KD范圍附近的凝膠顆粒填充層析柱，以中性磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，將得到的粗酶液上樣到層析柱上，以中性磷酸鹽緩沖液進行洗脫，收集活性峰所對應的洗脫液，將所得的洗脫液進行超濾濃縮，得到凝膠過濾粗酶液；

c、離子交換層析

用陰離子交換樹脂填充離子交換柱，以中性磷酸鹽緩沖液平衡離子交換柱，將凝膠過濾粗酶液上樣到離子交換柱上，以去離子水沖洗離子交換柱，再以中性磷酸鹽緩沖液進行洗脫，收集活性峰所對應的洗脫液，將所得的洗脫液進行超濾濃縮，得到離子交換粗酶液；

d、親和層析

用Sepharose4B填充親和層析柱，將脂肪酶抑制劑作為配體通過共價鍵偶聯到Sepharose4B上，以中性磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，將離子交換粗酶液上樣到層析柱上，以去離子水沖洗層析柱，再以0.1M?pH3-5檸檬酸緩沖液進行洗脫，收集洗脫液，將所得的洗脫液立即用弱堿性磷酸鹽緩沖液中和至中性，進行超濾濃縮并除鹽，得到純酶液；

e、聚乙二醇沉淀

在得到的純酶液中加入聚乙二醇，使脂肪酶沉淀下來，然后于4℃/3000-5000g離心5-10min，收集離心沉淀，將離心沉淀放入冷凍干燥機內干燥，得到脂肪酶凍干粉。