[發(fā)明專(zhuān)利]一種大規(guī)模制備高產(chǎn)率、高純度、高安全的口蹄疫全病毒顆粒標(biāo)記疫苗的方法及其產(chǎn)品

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410643314.3
• 申請(qǐng)日: 2015-08-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104491855A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-07-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 呂宏亮;張澍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 呂宏亮;張澍;內(nèi)蒙古必威安泰生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): A61K39/135
• 分類(lèi)號(hào): A61K39/135;C12N7/00;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;馬鑫

1.一種大規(guī)模制備高產(chǎn)率、高純度、高安全的口蹄疫全病毒顆粒標(biāo)記疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟：

a)100000L生物反應(yīng)器全懸浮培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞，細(xì)胞密度達(dá)到3-5×10⁶/毫升時(shí)按照病毒感染復(fù)數(shù)MOI0.01-0.1接種口蹄疫病毒細(xì)胞適應(yīng)株，制備病毒原液，攪拌速度不超過(guò)40rpm，培養(yǎng)4天收獲病毒液，使用制備型低速連續(xù)流離心機(jī)離心除去細(xì)胞碎片，同時(shí)收獲上清液和沉淀；沉淀在Triton-X-100存在的條件下裂解口蹄疫病毒感染細(xì)胞和細(xì)胞膜碎片，所述Triton-X-100的終濃度為0.1-0.2％，反復(fù)凍融3次后超聲3次，用制備型低速連續(xù)流離心機(jī)離心收集上清液，合并上清液；該步驟的質(zhì)量控制指標(biāo)為：口蹄疫病毒滴度為≥10⁷logTCID₅₀/mL，總蛋白量為5-7克，口蹄疫病毒146S含量為70-85μg/ml，非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC殘余量≤25ng/ml，牛血清白蛋白殘余量≤100ng/ml，BHK-21細(xì)胞殘余蛋白量≤100ng/ml，BHK-21細(xì)胞殘余DNA量≤5000pg/ml，Triton-X-100殘余量≤6000μg/ml，內(nèi)毒素≤150EU/毫升；

b)膜深層過(guò)濾、超濾、核酸酶解：

步驟a)得到的病毒上清液，依次經(jīng)過(guò)0.8μm、0.45μm、0.22μm的濾膜深層過(guò)濾和截留值為100,000-300,000MWCO的膜包或中空纖維柱10倍超濾；高度特異、高活性的核酸酶按20-50×10³單位/升加入到過(guò)濾后的上清液中，2-8℃作用9-18小時(shí)；該步驟的質(zhì)量控制指標(biāo)為：口蹄疫病毒滴度為10^7.0-10^8.0logTCID₅₀/mL，總蛋白量為6-6.5克，口蹄疫病毒146S含量為50-60μg/ml，非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC殘余量≤7ng/ml，牛血清白蛋白殘余量≤30ng/ml，BHK-21細(xì)胞殘余蛋白量≤90ng/ml，BHK-21細(xì)胞殘余DNA量≤4500pg/ml，Triton-X-100殘余量≤510μg/ml，內(nèi)毒素≤500EU/毫升；

c)強(qiáng)陰離子交換吸附床或吸附膜純化：

經(jīng)步驟b)酶解后的病毒上清液，經(jīng)0.22μm膜過(guò)濾，然后通過(guò)強(qiáng)陰離子交換吸附膜或吸附床，進(jìn)行分步洗脫；該步驟的質(zhì)量控制指標(biāo)為：口蹄疫病毒滴度為10^7.0-10^8.0logTCID₅₀/mL，總蛋白量為2-3克，口蹄疫病毒146S含量為30-40μg/ml，非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC殘余量≤5ng/ml，牛血清白蛋白殘余量≤75ng/ml，BHK-21細(xì)胞殘余蛋白量≤50ng/ml，BHK-21細(xì)胞殘余DNA量≤2500pg/ml，Triton-X-100殘余量≤850μg/ml；

d)PEG沉淀、氯仿異戊醇抽提：

經(jīng)步驟c)處理后的病毒上清液用PEG沉淀，緩沖液重懸沉淀，病毒重懸液經(jīng)含抽提液抽提，所述抽提液是通過(guò)將三氯甲烷和異戊醇按24:1體積比混合后得到的；

該步驟的質(zhì)量控制指標(biāo)為：口蹄疫病毒滴度為10^7.0-10^8.0logTCID₅₀/mL，總蛋白量為3-4.2克，口蹄疫病毒146S含量為50-60μg/ml，非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC殘余量≤15ng/ml，牛血清白蛋白殘余量≤90ng/ml，BHK-21細(xì)胞殘余蛋白量≤60ng/ml，BHK-21細(xì)胞殘余DNA量≤3500pg/ml，Triton-X-100殘余量≤400μg/ml，PEG殘余量≤250μg/ml，三氯甲烷殘余量≤350μg/ml，內(nèi)毒素≤55EU/毫升；

e)滅活；

0.025％二乙烯亞胺，4℃滅活48小時(shí)或37℃滅活2小時(shí)；

f)蔗糖密度梯度離心純化：

步驟e)的滅活液通過(guò)連續(xù)流60％蔗糖等密度梯度超速離心純化，該步驟質(zhì)量控制指標(biāo)為：總蛋白量2-2.5克，口蹄疫病毒146S含量為20-30μg/ml，非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC殘余量≤4ng/ml，牛血清白蛋白殘余量≤50ng/ml，BHK-21細(xì)胞殘余蛋白量≤60ng/ml，BHK-21細(xì)胞殘余DNA量≤2000pg/ml，Triton-X-100殘余量≤250μg/ml，PEG殘余量≤200μg/ml，三氯甲烷殘余量≤400μg/ml，內(nèi)毒素≤800EU/毫升；

g)超濾透析、除菌過(guò)濾：

經(jīng)步驟f)純化后的病毒液經(jīng)超濾透析并濃縮25-50倍，病毒液經(jīng)0.22μm膜除菌過(guò)濾，該步驟質(zhì)量控制指標(biāo)為：總蛋白量2-2.5克，口蹄疫病毒146S含量為20-30μg/ml，非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC殘余量≤3ng/ml，牛血清白蛋白殘余量≤50ng/ml，BHK-21細(xì)胞殘余蛋白量≤30ng/ml，BHK-21細(xì)胞殘余DNA量≤100pg/ml，三氯甲烷殘留量≤20μg/ml、PEG殘余量≤10μg/ml、Triton?X-100殘余量≤15μg/ml，內(nèi)毒素≤35EU/毫升；

h)原液儲(chǔ)備或乳化配制。