[發(fā)明專利]檢測高油酸花生FAD2A和FAD2B基因位點突變基因型的引物及其PCR檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410642798.X
• 申請日: 2014-11-14
• 公開（公告）號: CN104328198A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發(fā)明（設計）人: 張新友;齊飛艷;黃冰艷;劉華;石磊;張忠信;董文召;湯豐收
• 申請（專利權）人: 河南省農業(yè)科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 鄭州市華翔專利代理事務所(普通合伙) 41122
• 代理人: 張愛軍

1.一種檢測高油酸花生FAD2A和FAD2B突變基因型的PCR引物，其特征在于：所述引物如下：?

（1）檢測ahFAD2A基因448bp處堿基突變的引物設計：

當檢測ahFAD2A基因448bp處無突變時，在花生野生型FAD2A基因序列-88bp處設計正向引物FAD2A-F，在花生野生型FAD2A基因序列448bp處設計反向引物FAD2A-WT-R；

FAD2A-F：5’?…...GATTACTGATTATTGACTT…...3’，

FAD2A-WT-R：?5’?…...GTTTTGGGACAAACACTTCACC…...3’；

當檢測ahFAD2A基因448bp處堿基突變時，在花生野生型FAD2A基因序列-88bp處設計正向引物FAD2A-F，在花生突變型FAD2A基因序列448bp處設計反向引物FAD2A-Mu-R；

FAD2A-F：5’?…...GATTACTGATTATTGACTT…...3’，

FAD2A-Mu-R：5’?…...GTTTTGGGACAAACACTTAGAT…...3’；

（2）檢測ahFAD2B基因442bp位點突變的引物設計：

當檢測ahFAD2B基因442bp位點無堿基插入時，在花生野生型FAD2B基因序列-80bp處設計正向引物FAD2B-F，在花生野生型FAD2B基因序列442bp處設計反向引物FAD2B-WT-R；

FAD2B-F：5’?…...CAGAACCATTAGCTTTG…...3’，

FAD2B-WT-R：5’?…...GACAAACACTTCGTCGCGTTAG…...3’；?

當檢測ahFAD2B基因442bp位點有堿基插入時，在花生野生型FAD2B基因-80bp處設計正向引物FAD2B-F，在花生突變型FAD2B基因序列442bp處設計反向引物FAD2B-Ins-R；

FAD2B-F：5’?…...CAGAACCATTAGCTTTG…...3’，

FAD2B-Ins-R：5’?…...GACAAACACTTCGTCGCGTTAT…...3’。

2.一種利用權利要求1所述的高油酸花生FAD2A和FAD2B突變基因型的PCR檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

（1）PCR擴增：?PCR反應體系總體積為10μL，包括1U的DNA聚合酶、1倍濃度的反應buffer，0.4?mM?dNTPs，上下游引物各3μM，20ng的DNA樣本；

所述上下游引物為FAD2A-F和FAD2A-WT-R、FAD2A-F和FAD2A-Mu-R、FAD2B-F和FAD2B-WT-R、FAD2B-F和FAD2B-Ins-R四對中的一對；

PCR擴增程序：94℃預變性5?min；94℃變性30?s，45.9℃退火30?s，72℃延伸45?s，30或35次循環(huán)；最后72℃延伸10?min；

（2）電泳檢測：將四對引物的PCR產物分別進行瓊脂糖凝膠電泳；

（3）電泳后在凝膠成像儀中檢測PCR產物，組合分析四對引物的電泳結果，得到樣本對應的基因型。

3.根據(jù)權利要求2所述的PCR檢測方法，其特征在于，其中引物FAD2A-F和FAD2A-WT-R的PCR反應為30次循環(huán)，F(xiàn)AD2A-F和FAD2A-Mu-R、FAD2B-F和FAD2B-WT-R、FAD2B-F和FAD2B-Ins-R的PCR反應為35次循環(huán)。

4.權利要求2或3所述的PCR檢測方法在回交育種和基因型鑒定中的應用。