[發明專利]一種共固定化雙酶催化合成海藻糖的方法

無效

• 申請號: 201410638714.5
• 申請日: 2014-11-13
• 公開（公告）號: CN104328107A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發明（設計）人: 黃和;江凌;崔懷言;晏曉琴;李霜
• 申請（專利權）人: 南京海和生物科技有限公司
• 主分類號: C12N11/10
• 分類號: C12N11/10;C12N11/04;C12P19/12
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所 32230
• 代理人: 徐蓓

技術領域

本發明涉及一種共固定化雙酶催化合成海藻糖的方法，屬于功能糖醇合成技術領域。具體涉及用淀粉作為原料催化合成海藻糖的方法。

背景技術

海藻糖（Trehalose）是兩個葡萄糖分子以α,α-1,1糖苷鍵結合形成的非還原性二糖，海藻糖無半縮醛羥基，化學性質穩定。自1832年Wiggers首次從麥角菌中提取出海藻糖之后，海藻糖被發現廣泛存在于自然界的動物、植物及微生物中，如細菌、古生菌、酵母、蘑菇及無脊椎動物。由于海藻糖在高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等惡劣環境條件下能在細胞表面形成獨特的保護膜，有效地保護蛋白質分子不變性失活，因此在科學界素有“生命之糖”的美譽。這一獨特的功能特性，使得海藻糖除了可以作為蛋白質藥物、酶、疫苗和其他生物制品的活性保護劑以外，還是保持細胞活性、保濕類化妝品的重要成分，更可作為防止食品劣化、保持食品新鮮風味、提升食品品質的獨特食品配料，具有廣闊的市場前景和應用價值。

現代的海藻糖的商品化制備方法主要包括化學合成法、微生物發酵法、酶轉化法。其中酶轉化法是目前海藻糖生產的主要途徑，許多生物體內都有合成海藻糖的酶系，可以利用基因工程手段高效表達出來，利用這些酶與底物進行催化反應，可以大規模的生產海藻糖。但是，海藻糖合酶屬于胞內酶，酶法生產海藻糖過程中通常要破碎菌體，提取與純化海藻糖合成酶系，而在破碎及純化過程中容易造成酶的損失，這無疑加大了企業的生產成本。

????南寧中諾生物工程有限責任公司通過細胞破碎以及雙酶提取后以木薯淀粉為原料經α-淀粉酶和普魯蘭酶水解，再通過利用麥芽寡糖基海藻糖合成酶（MTSase）和麥芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase）分步催化反應合成海藻糖，但由于破碎過程中容易造成酶的損失以及麥芽寡糖基海藻糖合成酶（MTSase）對麥芽糖并不產生轉化，導致麥芽糖大量積累，最終使得海藻糖的得率不能達到較高水平，同時MTHase的酶活力也較低，也成為雙酶反應的限制因素。

CN103146779A（一種利用全細胞催化合成海藻糖的方法）中介紹以生物表面活性劑為透性化試劑處理大腸桿菌細胞增加其細胞膜的通透性，從而可以利用全細胞催化麥芽糖底物生成海藻糖。利用全細胞催化合成海藻糖可以免去細胞破碎工序，海藻糖合成酶（Trehalose?synthase，簡稱TreS）可以直接作用于麥芽糖底物，將α,α-1,4糖苷鍵連接的麥芽糖通過分子內轉糖苷一步轉化為α,α-1,1糖苷鍵連接的海藻糖。該途徑只需一步反應，工藝簡單，但其底物麥芽糖相比較與淀粉價格仍舊比較高昂。

發明內容

本發明以淀粉為最初的催化底物，利用雙酶共固定化催化淀粉水解液合成海藻糖。

本發明所要解決的技術問題是克服現有雙酶催化體系中（麥芽寡糖基海藻糖合成酶（MTSase）和麥芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase））酶的利用率低以及在單酶（海藻糖合成酶（TreS））催化原料底物價格較高的問題，利用價格低廉的淀粉為催化底物以及利用單酶催化體系，提供一種新的固定化催化底物合成海藻糖的方法，降低原料成本，從而進一步降低海藻糖的生產成本。

為了克服所述技術問題，本發明的技術方案為：

??一種共固定化制備用于合成海藻糖雙酶微球的方法，制備并透性化處理含海藻糖合成酶的工程菌，在透性化處理的體系中加入至少一種糖化酶，其特征在于：在加入糖化酶之前的透性化體系中加入了海藻酸鈉，并將該體系滴加入含殼聚糖的體系中，制得用于催化淀粉水解液的共固定化雙酶微球。

本發明所述的方法，其特征在于：所述透性化體系采用磷酸緩沖鹽溶液，pH值為6-7；所述含殼聚糖的體系為酸性體系，含0.1?-0.2?mol/L的氯化鈣與1-1.5重量%的醋酸。

一種共固定化雙酶催化合成海藻糖的方法，所述方法的步驟為：

（1）制備并透性化處理含海藻糖合成酶的工程菌；

（2）在透性化處理的體系中加入糖化酶；

（3）共固定化制備雙酶微球；

（4）將微球與經α-淀粉酶催化反應后的淀粉水解液接觸反應獲得反應液；

（5）分離純化所述步驟（4）的反應液獲得海藻糖；

其特征在于，回收步驟（3）所述微球，與含經α-淀粉酶催化反應后的淀粉水解液接觸反應獲得反應液。

本發明所述的方法，其特征在于，反應的具體步驟為：