[發(fā)明專(zhuān)利]一種共固定化雙酶催化合成海藻糖的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410638714.5
• 申請(qǐng)日: 2014-11-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104328107A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-02-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃和;江凌;崔懷言;晏曉琴;李霜
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 南京海和生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N11/10
• 分類(lèi)號(hào): C12N11/10;C12N11/04;C12P19/12
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務(wù)所 32230
• 代理人: 徐蓓

1.一種共固定化制備用于合成海藻糖雙酶微球的方法，制備并透性化處理含海藻糖合成酶的工程菌，在透性化處理的體系中加入至少一種糖化酶，其特征在于：在加入糖化酶之前的透性化體系中加入了海藻酸鈉，并將該體系滴加入含殼聚糖的體系中，制得用于催化淀粉水解液的共固定化雙酶微球。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述透性化體系采用磷酸緩沖鹽溶液，pH值為6-7；所述含殼聚糖的體系為酸性體系，含0.1?-0.2?mol/L的氯化鈣與1-1.5%重量的醋酸。

3.一種共固定化雙酶催化合成海藻糖的方法，所述方法的步驟為：

（1）制備并透性化處理含海藻糖合成酶的工程菌；

（2）在透性化處理的體系中加入糖化酶；

（3）共固定化制備雙酶微球；

（4）將微球與經(jīng)α-淀粉酶催化反應(yīng)后的淀粉水解液接觸反應(yīng)獲得反應(yīng)液；

（5）分離純化所述步驟（4）的反應(yīng)液獲得海藻糖；

其特征在于，回收步驟（3）所述微球，與含經(jīng)α-淀粉酶催化反應(yīng)后的淀粉水解液接觸反應(yīng)獲得反應(yīng)液。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，反應(yīng)的具體步驟為：

（1）制備并透性化處理含海藻糖合成酶的工程菌；包括培養(yǎng)海藻糖合成酶的大腸桿菌，在OD₆₀₀值為0.6-0.8時(shí)加入誘導(dǎo)劑產(chǎn)酶6-8小時(shí)，獲得發(fā)酵液；離心分離獲得菌體；加入與發(fā)酵液體系相當(dāng)?shù)?.1-0.4?g/L的脂肽類(lèi)生物表面活性劑溶液，于20-25℃，100-200?rpm下反應(yīng)30-60?min；離心分離獲得菌體，并用與發(fā)酵液體系相當(dāng)?shù)牧姿猁}緩沖液重懸；獲得3份體積的菌體；

（2）在透性化處理的體系中加入糖化酶，包括加入1份體積含2-3重量%的海藻酸糖化酶溶液，混合均勻；

（3）共固定化制備雙酶微球，包括將步驟（1）所述溶液滴加至含有0.1?-0.2?mol/L的氯化鈣與1-1.5%重量的醋酸的1%-2%的殼聚糖溶液中，且保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)直至滴加結(jié)束30min，制得雙酶固定化微球；

（4）將微球與經(jīng)α-淀粉酶催化反應(yīng)后的淀粉水解液接觸反應(yīng)獲得反應(yīng)液，包括用α-淀粉酶水解含淀粉原料，控制反應(yīng)的終點(diǎn)DE值為19-22，獲得淀粉水解液，并在上述反應(yīng)液中加入雙酶固定化微球，反應(yīng)24-30?小時(shí)，反應(yīng)條件為45-60?℃，pH?4.8-5.3，攪拌轉(zhuǎn)速100-200?rpm；

（5）分離純化所述步驟（4）的反應(yīng)液獲得海藻糖；

（6）回收步驟（4）所述微球與含經(jīng)α-淀粉酶催化反應(yīng)后的淀粉水解液接觸反應(yīng)獲得反應(yīng)液。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟（1）所述工程菌為含有鹽堿地宏基因組（Saline-Alkali?Soil?Metagenomes）的海藻糖合成酶基因，并能表達(dá)合成海藻糖合成酶。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟（1）所述的制備并透性化處理步驟包含菌種活化、培養(yǎng)、誘導(dǎo)、產(chǎn)酶、離心分離、脂肽類(lèi)生物表面活性劑處理、二次、重懸細(xì)胞的步驟，其重懸體系所用磷酸鹽磷酸根濃度為0.01-0.04?mol/L。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟（5）中所述方法為固液分離方法，優(yōu)選壓濾機(jī)，篩孔小于14目。

8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，淀粉水解液的DE值為19-22，制備水解液的淀粉的干物質(zhì)濃度為25-30%，α-淀粉酶的用量為5-10?U/g淀粉，糖化酶的用量為30-35?U/g淀粉。

9.上述任一權(quán)利要求所述的淀粉，包括葛根淀粉、玉米淀粉、土豆淀粉及紅薯淀粉。