[發明專利]一種肝干細胞的長期體外培養和定向分化體系和方法

有效

• 申請號: 201410635815.7
• 申請日: 2014-11-12
• 公開（公告）號: CN104388383A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發明（設計）人: 李文林;呂林潔;張木子;孫平新
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074;C12N5/071;C12Q1/02;A61K35/407;A61P1/16;A61L27/38
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 趙青

技術領域

本發明涉及生物醫藥工程技術領域，具體涉及一種肝干細胞的長期體外培養和定向分化體系和方法，包括一種化學成份明確的擴增培養基，用于小鼠或人肝干細胞的體外培養；以及一種化學成份明確的分化培養基，用于將小鼠或人肝干細胞誘導分化為成熟肝細胞。

背景技術

我國每年因肝病死亡的患者超過30萬，但是每年可供移植肝臟僅能滿足5％肝病患者的需求。可供移植肝臟的匱乏嚴重限制了該治療手段的臨床應用。已有的臨床前和臨床研究表明，成熟肝細胞或肝干細胞移植后可在損傷肝臟中再植并重建肝臟，但是無論是成熟肝細胞或者肝干細胞同樣存在來源匱乏的問題。

將人多能干細胞(胚胎干細胞和誘導多潛能干細胞)體外誘導分化為可體外穩定培養的肝干細胞不僅可為肝病患者的細胞移植提供穩定的細胞來源，且避免了利用胎肝組織所涉及的倫理學問題，優勢顯而易見。但是目前多能干細胞的定向誘導大多都是通過多步驟的時序性的分化過程，最終獲得有功能的、終末分化的細胞(Wobus?AM?&?Boheler?KR?Embryonic?Stem?Cells:Prospects?for?Developmental?Biology?and?Cell?Therapy.Physiol.Rev.2005；85(2):635-678。)目前，仍無法將分化體系穩定地維持在特定的中間發育階段，比如組織干細胞階段。同時，目前也無有效的將人多能干細胞誘導分化為可穩定擴增的肝干細胞的方法。

因此，本領域尚缺乏有效手段擴增肝干細胞，尤其是無法在化學成分明確的培養條件下實現肝干細胞的如長期體外培養和定向分化。

發明內容

本發明的目的在于提供一種肝干細胞的長期體外培養和定向分化體系，該體系包括一種化學成份明確的擴增培養基，用于小鼠或人肝干細胞的體外培養；以及一種化學成份明確的分化培養基，用于將小鼠或人肝干細胞誘導分化為成熟肝細胞。

本發明的另一目的在于提供一種肝干細胞的長期體外培養和定向分化的方法，該方法可將人多能干細胞誘導分化為肝干細胞，并且可以維持肝干細胞長期穩定擴增并保持定向分化為成熟肝細胞的能力。

本發明的第一方面，是提供一種小鼠或人肝干細胞的長期體外培養體系，該體系是一種化學成份明確的用于培養小鼠或人肝干細胞的擴增培養基，所述的擴增培養基包括：

液體基礎培養基，

0.1％-10％(體積百分含量)胰島素-轉鐵蛋白-亞硒酸鈉混合液，

3nM-10μM的糖原合成激酶3β抑制劑，

0.1μM-50μM的轉化生長因子β受體抑制劑，

0.1μM-50μM的溶血磷脂酸，

0.1μM-50μM的1-磷酸鞘氨醇，

0.1-100ng/mL的表皮生長因子，

和0.1-1mg/mL的人重組白蛋白或者牛血清白蛋白。

所述的液體基礎培養基，選自MEM細胞培養基、DMEM細胞培養基、DMEM/F12細胞培養基、IMDM細胞培養基、199細胞培養基、F10細胞培養基、F12細胞培養基、1640細胞培養基中的一種或兩種以上。

優選的，所述的擴增培養基含有0.5μM-5μM的糖原合成激酶3β抑制劑；

優選的，所述的擴增培養基含有1μM-10μM的轉化生長因子β受體抑制劑；

優選的，所述的擴增培養基含有1μM-10μM的溶血磷脂酸；

優選的，所述的擴增培養基含有0.1μM-5μM的1-磷酸鞘氨醇；

優選的，所述的擴增培養基含有1-50ng/mL的表皮生長因子。

優選的，所述的擴增培養基還包括：0.1-5mM尼克酰胺和0.1-100μg/mL的維生素C。

所述的糖原合成激酶3β抑制劑可以是CHIR99021或者其他小分子糖原合成激酶3β抑制劑；

所述的轉化生長因子β受體抑制劑可以是E-616452或者其他轉化生長因子β受體抑制劑。

本發明的第二方面，是提供一種小鼠或人肝干細胞的定向分化體系，該體系是一種化學成份明確的可以將肝干細胞誘導分化為成熟肝細胞的分化培養基，所述的分化培養基包括：

液體基礎培養基，

0.1-100ng/mL肝細胞生長因子,

0.1-100ng/mL抑瘤素M，

10nM-10μM的地塞米松，

10nM-10μM的γ-分泌酶抑制劑Compound?E，和

0.1μM-50μM的轉化生長因子β受體抑制劑E-616452。