[發明專利]一種肝干細胞的長期體外培養和定向分化體系和方法

有效

• 申請號: 201410635815.7
• 申請日: 2014-11-12
• 公開（公告）號: CN104388383A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發明（設計）人: 李文林;呂林潔;張木子;孫平新
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074;C12N5/071;C12Q1/02;A61K35/407;A61P1/16;A61L27/38
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 趙青

1.一種小鼠或人肝干細胞的長期體外培養體系，其特征在于，該體系是一種化學成份明確的用于培養小鼠或人肝干細胞的擴增培養基，所述的擴增培養基包括：

液體基礎培養基，

0.1％-10％的胰島素-轉鐵蛋白-亞硒酸鈉混合液，

3nM-10μM的糖原合成激酶3β抑制劑，

0.1μM-50μM的轉化生長因子β受體抑制劑，

0.1μM-50μM的溶血磷脂酸，

0.1μM-50μM的1-磷酸鞘氨醇，

0.1-100ng/mL的表皮生長因子，和

0.1-1mg/mL的人重組白蛋白或者牛血清白蛋白；

所述的液體基礎培養基，選自MEM細胞培養基、DMEM細胞培養基、DMEM/F12細胞培養基、IMDM細胞培養基、199細胞培養基、F10細胞培養基、F12細胞培養基、1640細胞培養基中的一種或兩種以上。

2.根據權利要求1所述的一種小鼠或人肝干細胞的長期體外培養體系，其特征在于，所述的擴增培養基包括：

0.5μM-5μM的糖原合成激酶3β抑制劑；

1μM-10μM的轉化生長因子β受體抑制劑；

1μM-10μM的溶血磷脂酸；

0.1μM-5μM的1-磷酸鞘氨醇；

1-50ng/mL的表皮生長因子。

3.根據權利要求1所述的一種小鼠或人肝干細胞的長期體外培養體系，其特征在于，所述的擴增培養基還包括：0.1-5mM尼克酰胺和0.1-100μg/mL的維生素C。

4.一種小鼠或人肝干細胞的定向分化體系，其特征在于，該體系是一種化學成份明確的可以將肝干細胞誘導分化為成熟肝細胞的分化培養基，所述的分化培養基包括：

液體基礎培養基，

0.1-100ng/mL肝細胞生長因子,

0.1-100ng/mL抑瘤素M，

10nM-10μM的地塞米松，

10nM-10μM的γ-分泌酶抑制劑Compound?E，和

0.1μM-50μM的轉化生長因子β受體抑制劑E-616452；

所述的液體基礎培養基，選自MEM細胞培養基、DMEM細胞培養基、DMEM/F12細胞培養基、IMDM細胞培養基、199細胞培養基、F10細胞培養基、F12細胞培養基、1640細胞培養基中的一種或兩種以上。

5.根據權利要求4所述的一種小鼠或人肝干細胞的定向分化體系，其特征在于，所述的分化培養基包括：

5-50ng/mL肝細胞生長因子；

5-50ng/mL抑瘤素M；

50nM-5μM的地塞米松；

100nM-5μM的γ-分泌酶抑制劑Compound?E；

1μM-20μM的轉化生長因子β受體抑制劑E-616452。

6.一種小鼠或人肝干細胞的長期體外培養和定向分化的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

A、利用如權利要求1-3任一所述的擴增培養基，從肝母細胞中選擇性擴增肝干細胞，并對肝干細胞進行體外培養和傳代；

B、利用如權利要求4或5所述的分化培養基，將步驟A獲得的肝干細胞誘導分化為成熟肝細胞。

7.一種如權利要求6所述的小鼠或人肝干細胞的長期體外培養和定向分化的方法制備得到的肝干細胞和成熟肝細胞。

8.一種如權利要求7所述的肝干細胞和成熟肝細胞在制備肝臟疾病的治療細胞、肝臟組織工程、肝臟疾病體外藥物篩選中的應用。