[發明專利]Ⅱ型草魚呼腸孤病毒的NASBA-ELISA檢測引物、探針及試劑盒

有效

• 申請號: 201410633166.7
• 申請日: 2014-11-11
• 公開（公告）號: CN104388588B
• 公開（公告）日: 2017-02-15
• 發明（設計）人: 曾偉偉;王慶;王英英;石存斌;李瑩瑩;任燕;宋新建
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院珠江水產研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司44205
• 代理人: 鄭瑩

技術領域

本發明屬于病毒分子生物學領域，涉及一種草魚呼腸孤病毒體外檢測方法，特別是一種Ⅱ型草魚呼腸孤病毒NASBA-ELISA?檢測試劑盒。

背景技術

草魚呼腸孤病毒（Grass?carp?reovirus，GCRV）隸屬水生呼腸孤病毒屬，為呼腸孤病毒科一新成員，是中國大陸分離的第一株魚類病毒。該病毒主要引起中國、越南、緬甸等亞洲國家淡水養殖中的草魚品種在魚種階段發生出血病，死亡率可高達60%以上。該病毒流行廣、危害大、死亡率高、發病季節長，嚴重威脅漁業生產。草魚呼腸孤病毒具雙層衣殼，病毒粒子平均直徑為60?nm-70nm，二十面體對稱，無囊膜，基因組由11條分節段的雙鏈RNA組成。目前己經報道了30多個分離株，包括GCRV854、GCRV861、GCRV873、GCRV875、GCRV876、GCRV991、GCRV?H962、ZV-8802、GCRV-854、GCRV?HZ08、GCRV?JX09-01、GCRV?JX09-02、GCRV?GD10、GCRV?GCRV104株等，不同分離株在基因組序列、基因組帶型、細胞病變、對草魚的致病力等方面差異較大。到目前為止，已完成全基因組序列分析的毒株有GCRV?873株、GCRV?HZ08、GCRV?GD10、GCRV?104等，也有比較多的毒株只完成了部分節段或者部分序列的測序工作。草魚呼腸孤病毒比較復雜，不同分離株的各基因節段存在重配和抗原漂移現象，使得目前還沒在血清學或者基因型上對其進行亞型分類。但是通過現有的分離株序列信息來看，至少應該有三類，各類的代表株分別是：第一類為873株和JX09-01株，第二類為HZ08株和GD10株，第三類型為104株。在相關的研究報道中已有提到將其進行基因分型的探討，即分別把一、二和三類按照基因序列差異分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。同一亞型的毒株，其對應各節段基因同源性均在95%以上。當前，全國各地分離到的流行株中，三類亞型均有報道，有的單獨感染，也有混合感染。根據近幾年的草魚出血病監測和流行病學調查分析表明，目前導致草魚出血病流行和爆發的最主要為GCRV?Ⅱ型。

目前，檢測草魚呼腸孤病毒的方法有多種，如病毒分離、電鏡觀察、核酸帶型分析、RT-PCR?和實時熒光RT-PCR?技術。病毒分離敏感度不高，特別是對于沒有明顯細胞病變的?Ⅱ型草魚呼腸孤病毒，而且操作煩瑣，成本較高，周期較長，對病料的要求較高。目前，廣泛應用的常規RT-PCR?檢測方法簡單、方便、快速，但仍存在假陽性和PCR?污染的問題；實時熒光RT-PCR?(?real-time?RT-PCR)?技術雖然靈敏度較高，但儀器設備和技術含量都要求較高，不適合基層獸醫部門的診斷。

依賴核酸序列的擴增(?nucleuic?acid?sequence?based?amplification，NASBA)?是在PCR?基礎上發展起來的一種新技術。NASBA-ELISA方法是將NASBA?技術和ELISA?(酶聯免疫吸附劑測定)?方法相結合，其原理是將地高辛標記到檢測探針上，通過探針捕獲探針將地高辛標記的探針和NASBA?產物的復合物吸附到微量反應板上，作用于底物硝基苯基磷酸鹽顯色，然后通過分析吸光度來檢測RNA?產物。由于捕獲探針和檢測探針的應用，使檢測結果更為特異，而酶標儀的高通量性能使一次能夠檢測多個樣品。當前，還沒有建立草魚呼腸孤病毒NASBA檢測方法的報道。

發明內容

本發明的一個目的在于提供一種Ⅱ型草魚呼腸孤病毒NASBA-ELISA檢測引物、探針及試劑盒。

本發明的另一個目的在于提供上述引物、探針及試劑盒在檢測Ⅱ型草魚呼腸孤病毒中的應用。

本發明所采取的技術方案是：

Ⅱ型草魚呼腸孤病毒NASBA-ELISA檢測引物及探針，其針對Ⅱ型草魚呼腸孤病毒S6節段保守區域。所述引物及探針的序列如下所示：

（1）Ⅱ型GCRV?S6基因一對特異性引物：

S6-F:5-GATGCAAGGTCGCATATGAGCAGACGGGTCACCGTATTGTTACA-3’（SEQ?ID?NO.1)，

S6-R：5’-AATTCTAATACGACTCACTAAAGGGAGAAGGGAACTCATCAGTAAAGTCGGA-3’?（SEQ?ID?NO.2)；

（2）Ⅱ型GCRV?S6基因特異性捕獲探針：

S6-CP：5'BIO-TCAGCAGGTGCCGTTAATTTGT-3'（SEQ?ID?NO.3)；

（3）Ⅱ型GCRV?S6基因特異性檢測探針