[發明專利]Ⅱ型草魚呼腸孤病毒的NASBA-ELISA檢測引物、探針及試劑盒

有效

• 申請號: 201410633166.7
• 申請日: 2014-11-11
• 公開（公告）號: CN104388588B
• 公開（公告）日: 2017-02-15
• 發明（設計）人: 曾偉偉;王慶;王英英;石存斌;李瑩瑩;任燕;宋新建
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院珠江水產研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司44205
• 代理人: 鄭瑩

1.Ⅱ型草魚呼腸孤病毒NASBA-ELISA檢測引物及探針，其特征在于，所述引物及探針針對Ⅱ型草魚呼腸孤病毒S6節段保守區域。

2.根據權利要求1所述的Ⅱ型草魚呼腸孤病毒NASBA-ELISA檢測引物及探針，其特征在于，所述引物及探針的序列如下所示：

（1）Ⅱ型GCRV?S6基因一對特異性引物：

S6-F:5-GATGCAAGGTCGCATATGAGCAGACGGGTCACCGTATTGTTACA-3’（SEQ?ID?NO.1)，

S6-R：5’-AATTCTAATACGACTCACTAAAGGGAGAAGGGAACTCATCAGTAAAGTCGGA-3’?（SEQ?ID?NO.2)；

（2）Ⅱ型GCRV?S6基因特異性捕獲探針：

S6-CP：5'BIO-TCAGCAGGTGCCGTTAATTTGT-3'（SEQ?ID?NO.3)；

（3）Ⅱ型GCRV?S6基因特異性檢測探針

S6-DP：5'-TGATGCAAGGTCGCATATGAG-DIG3'（SEQ?ID?NO.4)。

3.一種用于檢測Ⅱ型草魚呼腸孤病毒的NASBA-ELISA試劑盒，其含有權利要求1或2所述的引物及探針。

4.根據權利要求3所述的用于檢測Ⅱ型草魚呼腸孤病毒的NASBA-ELISA試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還含有NASBA擴增緩沖液，酶混合液，擴增產物檢測試劑，陰性對照和陽性對照。

5.根據權利要求4所述的用于檢測Ⅱ型草魚呼腸孤病毒的NASBA-ELISA試劑盒，其特征在于，所述NASBA擴增緩沖液含有：?pH?8.5?Tris-HCl?50?mmol/L，KCl?50?mmol/L，?MgCl₂?12?mmol/L，DTT?5?mmol/L，dNTP?2?mmol/L，NTP?10?mmol/L，DMSO?100?g/L。

6.根據權利要求4所述的用于檢測Ⅱ型草魚呼腸孤病毒的NASBA-ELISA試劑盒，其特征在于，所述酶混合液含有：AMV反轉錄酶20U?，T7?RNA聚合酶40U，核糖核酸酶H??0.8U。

7.根據權利要求4所述的用于檢測Ⅱ型草魚呼腸孤病毒的NASBA-ELISA試劑盒，其特征在于，所述擴增產物檢測試劑的組成為：

（1）鏈霉親和素包被的96孔酶標板；

（2）雜交緩沖液：20×SSPE（pH7.4），50mM/L?Tris-HCl（pH8.8），1%（W/V）BSA?45μL；

（3）酶標抗體：堿性磷酸酶抗地高辛抗體?100μL；

（4）洗液：PBST溶液500μL；

（5）顯色液：3mg?pNPP?溶于1mL?ddH₂O中，加入1ml二乙醇胺，避光-20℃保存，100μL；

（6）終止液：0.5M?Na2CO3?溶液?100μL。

8.根據權利要求4所述的用于檢測Ⅱ型草魚呼腸孤病毒的NASBA-ELISA試劑盒，其特征在于，所述陽性對照為GCRV?HZ08株病毒液提取的RNA，所述陰性對照為未感染草魚呼腸孤病毒的健康草魚內臟組織提取的總RNA。

9.權利要求3～8任一項所述的試劑盒在檢測Ⅱ型草魚呼腸孤病毒中的應用。