[發(fā)明專利]Ⅱ型草魚呼腸孤病毒的NASBA-ELISA檢測引物、探針及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410633166.7
• 申請日: 2014-11-11
• 公開（公告）號: CN104388588B
• 公開（公告）日: 2017-02-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曾偉偉;王慶;王英英;石存斌;李瑩瑩;任燕;宋新建
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標事務(wù)所有限公司44205
• 代理人: 鄭瑩

1.Ⅱ型草魚呼腸孤病毒NASBA-ELISA檢測引物及探針，其特征在于，所述引物及探針針對Ⅱ型草魚呼腸孤病毒S6節(jié)段保守區(qū)域。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Ⅱ型草魚呼腸孤病毒NASBA-ELISA檢測引物及探針，其特征在于，所述引物及探針的序列如下所示：

（1）Ⅱ型GCRV?S6基因一對特異性引物：

S6-F:5-GATGCAAGGTCGCATATGAGCAGACGGGTCACCGTATTGTTACA-3’（SEQ?ID?NO.1)，

S6-R：5’-AATTCTAATACGACTCACTAAAGGGAGAAGGGAACTCATCAGTAAAGTCGGA-3’?（SEQ?ID?NO.2)；

（2）Ⅱ型GCRV?S6基因特異性捕獲探針：

S6-CP：5'BIO-TCAGCAGGTGCCGTTAATTTGT-3'（SEQ?ID?NO.3)；

（3）Ⅱ型GCRV?S6基因特異性檢測探針

S6-DP：5'-TGATGCAAGGTCGCATATGAG-DIG3'（SEQ?ID?NO.4)。

3.一種用于檢測Ⅱ型草魚呼腸孤病毒的NASBA-ELISA試劑盒，其含有權(quán)利要求1或2所述的引物及探針。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測Ⅱ型草魚呼腸孤病毒的NASBA-ELISA試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還含有NASBA擴增緩沖液，酶混合液，擴增產(chǎn)物檢測試劑，陰性對照和陽性對照。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于檢測Ⅱ型草魚呼腸孤病毒的NASBA-ELISA試劑盒，其特征在于，所述NASBA擴增緩沖液含有：?pH?8.5?Tris-HCl?50?mmol/L，KCl?50?mmol/L，?MgCl₂?12?mmol/L，DTT?5?mmol/L，dNTP?2?mmol/L，NTP?10?mmol/L，DMSO?100?g/L。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于檢測Ⅱ型草魚呼腸孤病毒的NASBA-ELISA試劑盒，其特征在于，所述酶混合液含有：AMV反轉(zhuǎn)錄酶20U?，T7?RNA聚合酶40U，核糖核酸酶H??0.8U。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于檢測Ⅱ型草魚呼腸孤病毒的NASBA-ELISA試劑盒，其特征在于，所述擴增產(chǎn)物檢測試劑的組成為：

（1）鏈霉親和素包被的96孔酶標板；

（2）雜交緩沖液：20×SSPE（pH7.4），50mM/L?Tris-HCl（pH8.8），1%（W/V）BSA?45μL；

（3）酶標抗體：堿性磷酸酶抗地高辛抗體?100μL；

（4）洗液：PBST溶液500μL；

（5）顯色液：3mg?pNPP?溶于1mL?ddH₂O中，加入1ml二乙醇胺，避光-20℃保存，100μL；

（6）終止液：0.5M?Na2CO3?溶液?100μL。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于檢測Ⅱ型草魚呼腸孤病毒的NASBA-ELISA試劑盒，其特征在于，所述陽性對照為GCRV?HZ08株病毒液提取的RNA，所述陰性對照為未感染草魚呼腸孤病毒的健康草魚內(nèi)臟組織提取的總RNA。

9.權(quán)利要求3～8任一項所述的試劑盒在檢測Ⅱ型草魚呼腸孤病毒中的應(yīng)用。