[發明專利]重組SIVgag與腸道病毒EV71型VP1融合基因的病毒樣顆粒及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201410631568.3
• 申請日: 2014-11-11
• 公開（公告）號: CN104371983B
• 公開（公告）日: 2017-11-17
• 發明（設計）人: 張惠中;王希;林芳;董軻;高萍
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C12N7/04
• 分類號: C12N7/04;C12N15/62;C12N15/866;A61K39/125;A61P31/14
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司61200
• 代理人: 蔡和平

技術領域

本發明屬于免疫技術領域，涉及一種病毒樣顆粒及其制備方法，具體涉及腸道病毒EV71型VP1基因病毒樣顆粒及其制備方法和應用。

背景技術

手足口病(Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD)是由一組腸道病毒引起的常見傳染性疾病，發病人群主要為5歲以下兒童，該病傳染性強，傳播途徑復雜，在短時間內即可造成大流行，近年來在我國持續爆發，嚴重危害公眾健康并帶來巨大社會負擔。因此，應用新的技術手段及策略，研發安全性高、免疫保護性強并利于產業化生產的新型手足口病疫苗具有重要的理論及實際應用意義。

引發手足口病的腸道病毒包括腸道病毒71型、A組柯薩奇病毒和埃可病毒等，其中腸道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)和柯薩奇病毒A16型(Coxsackievirus,CA16)為主要致病病毒。腸道病毒71型(EV71)屬于小RNA病毒科(Picornaradae)的腸道病毒屬(Enterovirus)，歸屬于人類腸道病毒A。該病毒為二十面體立體對稱的球形結構，無包膜和突出，直徑約24～30nm，核酸為單股正鏈RNA。在病毒復制過程中，病毒RNA首先翻譯出一條完整長肽，進而被自身蛋白酶識別并切割為P1、P2、P3等3條多肽；其中P1被再次酶解為VP4、VP2、VP3及VP1等4個結構蛋白；P2多肽被切割為2A、2B及2C等3條多肽；P3多肽被切割為3A、VPg、3C、3D等4條多肽。結構蛋白VP1、VP2、VP3及VP4構成原聚體，進而再拼裝成具有五聚體結構的亞單位，后者通過各自的結構域相互連接，最終由60個亞單位形成病毒的外殼。VP1、VP2和VP3三個多肽暴露在病毒外殼的表面，而VP4包埋在病毒外殼的內側與病毒核心緊密連接，研究表明，EV71病毒抗原表位基本位于殼蛋白VP1、VP2上，而VP1具有最多的特異性中和位點，因此成為研究的熱點。

病毒樣顆粒(Virus Like Particles,VLPs)是利用病毒的結構蛋白可在細胞內自行裝配成一個不含核酸成分的病毒粒子的特性開發的一種新的疫苗研發技術平臺。病毒樣顆粒具有眾多優點：①不具有感染性及核酸整合致病性，相對滅活減毒疫苗其安全性得到了保障；②VLPs保持了病毒蛋白空間結構，可通過和病毒感染相似的途徑將抗原呈遞給免疫細胞，有效誘導機體免疫系統產生免疫保護應答；③VLPs易規模化生產，可滿足臨床應用需要。目前常用的病毒結構蛋白有HBVs，HPV，SIV gag蛋白，HIV gag蛋白，Ebola病毒GP蛋白等。SIV gag基因編碼的蛋白可被蛋白水解酶裂解成3個結構蛋白，分別為基質(MA)、衣殼蛋白(CA)及核衣殼蛋白(NC)，可自我裝配成核心顆粒，以出芽方式分泌到細胞外時獲得包膜及膜蛋白。研究表明，gag的C端與多肽或外源性基因融合不影響gag自我組裝成VLPs的特性，而目前研究表明其它病毒的結構蛋白不具備此特性。

目前，用于制備病毒樣顆粒的平臺有：酵母表達系統，植物表達系統，哺乳動物表達系統，桿狀病毒表達系統等。利用重組桿狀病毒表達系統制備病毒樣顆粒，由于安全性高，產量大因而備受關注。重組桿狀病毒表達系統制備的VLPs又分為細胞內VLPs及分泌型VLPs，細胞內VLPs因組裝成的VLPs位于細胞內，限制了表達量，且純化過程相對繁瑣。Chung等在細胞中共表達EV71病毒P1和3CD區并組裝成VLPs，通過裂解細胞獲得疫苗，但該方法獲得的VLPs相對分泌型產量較低，制備流程繁瑣。

發明內容

本發明的目的在于提供一種以SIV gag結構蛋白為基礎重組SIV gag與腸道病毒EV71型VP1融合基因的病毒樣顆粒及其制備方法和應用，該方法制備過程簡便，易純化，結構均一，產量大，經本方法制得的gag-VP1病毒樣顆粒具有良好的免疫效果。

本發明是通過以下技術方案來實現：

一種重組SIV gag與腸道病毒EV71型VP1融合基因的病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒是將融合基因gag-VP1克隆到真核表達載體及桿狀病毒轉座載體中分別得到真核表達載體和重組轉座載體，然后真核表達載體轉染哺乳動物細胞，重組轉座載體轉化DH10Bac感受態細胞制得重組桿粒，將重組桿粒轉染TN5昆蟲細胞，經分泌表達制得；

其中，所述融合基因gag-VP1是以重疊PCR法獲得的SIV gag與EV71 VP1的融合基因，且融合基因gag-VP1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

融合基因gag-VP1大小為2458bp，91kDa。