[發明專利]重組SIVgag與腸道病毒EV71型VP1融合基因的病毒樣顆粒及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201410631568.3
• 申請日: 2014-11-11
• 公開（公告）號: CN104371983B
• 公開（公告）日: 2017-11-17
• 發明（設計）人: 張惠中;王希;林芳;董軻;高萍
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C12N7/04
• 分類號: C12N7/04;C12N15/62;C12N15/866;A61K39/125;A61P31/14
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司61200
• 代理人: 蔡和平

1.一種重組SIV gag與腸道病毒EV71型VP1融合基因的病毒樣顆粒，其特征在于，該病毒樣顆粒是將融合基因gag-VP1克隆到真核表達載體及桿狀病毒轉座載體中分別得到真核表達載體和重組轉座載體，然后真核表達載體轉染哺乳動物細胞，重組轉座載體轉化DH10Bac感受態細胞制得重組桿粒，將重組桿粒轉染TN5昆蟲細胞，經分泌表達制得；

其中，所述融合基因gag-VP1是以重疊PCR法獲得的SIV gag與EV71VP1的融合基因，且融合基因gag-VP1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；

融合基因gag-VP1大小為2458bp、91kDa；

所述真核表達載體為pCAGGs，融合基因gag-VP1克隆到pCAGGs載體所形成的重組質粒為gag-VP1-pCAGGs；

所述的桿狀病毒轉座載體為pFastBac^TM1，融合基因gag-VP1克隆到pFastBac^TM1所形成的重組轉座載體為gag-VP1-pFastBac^TM1。

2.一種重組SIV gag與腸道病毒EV71型VP1融合基因的病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)采用重疊PCR法制得融合基因gag-VP1，將融合基因gag-VP1克隆入桿狀病毒轉座載體pFastBac^TM1的EcoRI、NotI酶切位點之間，得到重組轉座載體gag-VP1-pFastBac^TM1；

2)將重組轉座載體gag-VP1-pFastBac^TM1轉化DH10Bac感受態細胞，與Bacmid進行重組，經鑒定，得到重組桿粒gag-VP1-Bacmid；

3)將重組桿粒gag-VP1-Bacmid轉染TN5昆蟲細胞，直至細胞病變率超過80％后，離心收集上清，得到P1代病毒，將P1代病毒連續傳代2次后，得到重組桿狀病毒rBV gag-VP1；

4)將重組桿狀病毒rBV gag-VP1以MOI為5接種TN5細胞，在28℃下懸浮培養72h后離心收集上清，經純化制得重組SIV gag與腸道病毒EV71型VP1融合基因的病毒樣顆粒；

所述的純化具體操作為：

首先，離心后收集上清，將得到的上清經GE Quixstand系統超濾純化，在4℃下進行濃縮；

然后，將濃縮產物經15％～50％的不連續蔗糖密度梯度，再在28000r/min、4℃的條件下超高速離心2h，收集不同濃度的蔗糖組分；

最后，用PBS洗滌，再經28000r/min超高速離心30min，沉淀經PBS重懸，得到純化后的重組SIV gag與腸道病毒EV71型VP1融合基因的病毒樣顆粒；

融合基因gag-VP1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

3.權利要求1所述的重組SIV gag與腸道病毒EV71型VP1融合基因的病毒樣顆粒在制備治療手足口病的疫苗中的應用。

4.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述的疫苗為抗EV71病毒感染的疫苗。