[發(fā)明專利]重組SIVgag與腸道病毒EV71型VP1融合基因的病毒樣顆粒及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410631568.3
• 申請日: 2014-11-11
• 公開（公告）號: CN104371983B
• 公開（公告）日: 2017-11-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張惠中;王希;林芳;董軻;高萍
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
• 主分類號: C12N7/04
• 分類號: C12N7/04;C12N15/62;C12N15/866;A61K39/125;A61P31/14
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責(zé)任公司61200
• 代理人: 蔡和平

1.一種重組SIV gag與腸道病毒EV71型VP1融合基因的病毒樣顆粒，其特征在于，該病毒樣顆粒是將融合基因gag-VP1克隆到真核表達載體及桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體中分別得到真核表達載體和重組轉(zhuǎn)座載體，然后真核表達載體轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞，重組轉(zhuǎn)座載體轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細胞制得重組桿粒，將重組桿粒轉(zhuǎn)染TN5昆蟲細胞，經(jīng)分泌表達制得；

其中，所述融合基因gag-VP1是以重疊PCR法獲得的SIV gag與EV71VP1的融合基因，且融合基因gag-VP1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；

融合基因gag-VP1大小為2458bp、91kDa；

所述真核表達載體為pCAGGs，融合基因gag-VP1克隆到pCAGGs載體所形成的重組質(zhì)粒為gag-VP1-pCAGGs；

所述的桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體為pFastBac^TM1，融合基因gag-VP1克隆到pFastBac^TM1所形成的重組轉(zhuǎn)座載體為gag-VP1-pFastBac^TM1。

2.一種重組SIV gag與腸道病毒EV71型VP1融合基因的病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)采用重疊PCR法制得融合基因gag-VP1，將融合基因gag-VP1克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體pFastBac^TM1的EcoRI、NotI酶切位點之間，得到重組轉(zhuǎn)座載體gag-VP1-pFastBac^TM1；

2)將重組轉(zhuǎn)座載體gag-VP1-pFastBac^TM1轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細胞，與Bacmid進行重組，經(jīng)鑒定，得到重組桿粒gag-VP1-Bacmid；

3)將重組桿粒gag-VP1-Bacmid轉(zhuǎn)染TN5昆蟲細胞，直至細胞病變率超過80％后，離心收集上清，得到P1代病毒，將P1代病毒連續(xù)傳代2次后，得到重組桿狀病毒rBV gag-VP1；

4)將重組桿狀病毒rBV gag-VP1以MOI為5接種TN5細胞，在28℃下懸浮培養(yǎng)72h后離心收集上清，經(jīng)純化制得重組SIV gag與腸道病毒EV71型VP1融合基因的病毒樣顆粒；

所述的純化具體操作為：

首先，離心后收集上清，將得到的上清經(jīng)GE Quixstand系統(tǒng)超濾純化，在4℃下進行濃縮；

然后，將濃縮產(chǎn)物經(jīng)15％～50％的不連續(xù)蔗糖密度梯度，再在28000r/min、4℃的條件下超高速離心2h，收集不同濃度的蔗糖組分；

最后，用PBS洗滌，再經(jīng)28000r/min超高速離心30min，沉淀經(jīng)PBS重懸，得到純化后的重組SIV gag與腸道病毒EV71型VP1融合基因的病毒樣顆粒；

融合基因gag-VP1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

3.權(quán)利要求1所述的重組SIV gag與腸道病毒EV71型VP1融合基因的病毒樣顆粒在制備治療手足口病的疫苗中的應(yīng)用。

4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的疫苗為抗EV71病毒感染的疫苗。