[發明專利]一種檢測奶牛乳腺組織lncRNA基因芯片的設計方法

在審

• 申請號: 201410629821.1
• 申請日: 2014-11-10
• 公開（公告）號: CN104561261A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 毛永江;朱小瑞;邢世宇;李銳;楊章平
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京鐘山專利代理有限公司 32252
• 代理人: 戴朝榮

技術領域

本發明屬于分子生物學和生物信息學交叉學科，特別涉及一種應用于奶牛乳腺組織lncRNA表達的檢測的基因芯片的設計方法。

背景技術

長鏈非編碼RNA(Long?non-coding?RNA,lncRNA)是長度大于200個核苷酸非編碼RNA，近幾年成為備受矚目的哺乳動物轉錄組重要成員。lncRNA能直接與染色質結合并募集作用因子發揮其作用，又能參與組蛋白修飾、募集調控因子修飾抑制因子等達到基因沉默。在轉錄前調控中，lncRNA通過與蛋白質相互作用參與轉錄水平的調控，如作為調控因子或共調控因子通過形成轉錄起始復合體實現調控；在轉錄后的調控中，lncRNA主要通過與靶基因的互補配對形成二聚體，掩蓋與轉錄加工的位點，以此來調控轉錄后水平的剪切、拼接和翻譯等過程。lncRNA的調控作用在生理和疾病過程中扮演的重要角色逐漸引起人們廣泛的關注。

隨著高通量測序技術和生物信息學領域的迅猛發展，lncRNA在各領域的研究已取得了一定的進展，各物種已鑒定的lncRNA的數量逐漸增加，目前人、大鼠和小鼠已有商業化的基因芯片，而其它物種只有依靠RNA測度測序，并結合已知數據庫查詢等方法來進行lncRNA研究。在牛lncRNA研究方面，已有數例相關報道，相關數據庫中已確認的lncRNA也較少，如ensembl數據庫為797條，Billerey等(2014)報道了利木贊牛背最長肌584條基因間lncRNA(lincRNAs)。另外，目前也無牛商業化的lncRNA芯片可供選擇。鑒于目前和將來有關lncRNA研究發展的需要，急需一種成本相對較低且快速的lncRNA檢測方法。而本研究設計的基于牛乳腺組織lncRNA基因芯片的設計方法，可以滿足國內外市場有關牛乳腺組織lncRNA的研究，同時對牛其它組織器官lncRNA表達、功能等方面的研究也有很好的借鑒作用。

發明內容

針對目前市場上并無商業化的可用于牛lncRNA研究的基因芯片的問題，本發明的目的是提供一種檢測奶牛乳腺組織lncRNA基因芯片的設計方法，以滿足對牛乳腺組織lncRNA研究的需要。

為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

一種檢測奶牛乳腺組織lncRNA基因芯片的設計方法，包括以下步驟：(1)以1頭正常泌乳奶牛和1頭患有乳房炎奶牛為樣本，取其乳腺組織，提取其總RNA，并混合；(2)混合后的總RNA去核糖體RNA，再去含polyA的RNA，以去除大部分coding序列；(3)得到的mRNA隨機打斷成為短片段，再以片斷后的mRNA為模板，合成cDNA第一鏈，再合成cDNA第二鏈，經過QiaQuick?PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫經末端修復、加堿基A，加測序接頭，然后降解第二條鏈；(4)然后進行片段大小選擇，進行PCR擴增，構建文庫；(5)最后建好的測序文庫用Illumina?HiSeqTM?2000進行測序；(6)然后獲取Clean?reads、Cufflinks重構轉錄本、non-coding?RNA庫注釋，和KEGG、NR、COG、SWISSPROT四個數據庫進行蛋白庫比對，過濾和去除mRNA，最后經CPC預測，得到所需要的Long?Chain?Non-Coding?RNA預測序列結果文件；(7)在此基礎上，根據牛編碼蛋白質的基因序列(即mRNA)和lncRNA序列，開發并設計同時檢測奶牛乳腺組織lncRNA和mRNA的芯片。

步驟(3)中，以片斷后的mRNA為模板，用六堿基隨機引物合成cDNA第一鏈，并加入緩沖液、dNTPs、RNase?H和DNA?polymerase?I合成cDNA第二鏈。

步驟(3)中，通過UNG(Uracil-N-Glycosylase)酶降解第二條鏈。

步驟(4)中，用瓊脂糖凝膠電泳進行片段大小選擇。

本發明的有益效果是：

按照傳統方法，對lncRNA和mRNA進行研究時，需要分別進行轉錄組測序外加基因表達譜芯片進行檢測，這樣每個樣本的成本大概為3-4萬元(按目前市場計算)，分析測試時間約為3個月。如引入本發明設計并開發的基因芯片，每個樣本成本只需6000元，節約成本3萬元/樣本左右，同時分析時間可縮短到20-30天以內。這樣不僅節約了成本，且大大縮短了分析時間，為科研人員贏得寶貴的時間。