[發明專利]DNA微陣列芯片檢測與Ⅱ型糖尿病相關的單核苷酸多態性的方法

有效

• 申請號: 201410628972.5
• 申請日: 2014-11-06
• 公開（公告）號: CN104388555B
• 公開（公告）日: 2017-09-22
• 發明（設計）人: 王振新;李桃;邢雪峰;鄔東陽
• 申請（專利權）人: 中國科學院長春應用化學研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 長春菁華專利商標代理事務所(普通合伙)22210
• 代理人: 南小平

1.一種DNA微陣列芯片檢測與Ⅱ型糖尿病相關的單核苷酸多態性的非疾病診斷目的的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)合成6條寡核苷酸修飾的金納米粒子標記物；

具體步驟如下：將6條100μM巰基修飾的寡核苷酸以SP₁:SP₂:SP₃:SP₄:SP₅:SP₆＝1.2:1.2:0.6:1:1.6:1.6的比例混合；取5μl該寡核苷酸混合溶液與300μl 8nM的金納米粒子混合均勻，室溫靜置反應10h，再加入等體積的PBS緩沖溶液，混合均勻后反應過夜；將反應后的溶液真空離心濃縮至100μl，通過離心提純反應產物，獲得6條寡核苷酸修飾的金納米粒子標記物；

其中所述寡核苷酸序列分別為：

SP₁：(T₁₀)CTCTCTTACATA，SP₂：(T₁₀)ATTTAAACCTTC，

SP₃：(T₁₀)TTCCTGGTTTCA，SP₄：(T₁₀)ACTTGATGCAAT，

SP₅：(T₁₀)ATAGACTTACTG，SP₆：(T₁₀)GGCAATTAAATT；

(2)篩選出用于Ⅱ型糖尿病6個突變位點檢測的6條特定寡核苷酸探針；

所述的6個突變位點分別為：rs11196205，rs11196218，rs6585205，rs10946398，rs10811661，rs7903146；

所述的6條特定寡核苷酸探針序列分別為：

P₁：CTGCTCGTAGTTATAA(T₁₀)-NH₂，

P_1A：CTGCTGGTAGTTATAA(T₁₀)-NH₂，

P₂：TCGGGTGCTTATGAAA(T₁₀)-NH₂，

P_2A：TCGGGTGTTTATGAAA(T₁₀)-NH₂，

P₃：TCTAAGTCGTGGGGCA(T₁₀)-NH₂，

P_3A：TCTAAGTAGTGGGGCA(T₁₀)-NH₂，

P₄：GACAGCATAACGATAC(T₁₀)-NH₂，

P_4A：GACAGCAGAACGATAC(T₁₀)-NH₂，

P₅：TCATGAGAAAACTAAA(T₁₀)-NH₂，

P_5A：TCATGGGAAAACTAAA(T₁₀)-NH₂，

P₆：ATATAGTATCTAAAAA(T₁₀)-NH₂，

P_6A：ATATAATATCTAAAAA(T₁₀)-NH₂；

(3)利用標準制作方法將特定寡核苷酸探針點樣液點樣到芯片上制備得到DNA微陣列芯片；

(4)用所述的DNA微陣列芯片對模擬Ⅱ型糖尿病的寡核苷酸靶標和Ⅱ型糖尿病實際樣品進行檢測，再用6條寡核苷酸修飾的金納米粒子標記物對檢測結果進行標記；

所述6條寡核苷酸修飾的金納米粒子標記物的平均粒徑為13nm；

所述特定寡核苷酸探針點樣液的點樣濃度為30μM；

步驟(4)中所述的模擬Ⅱ型糖尿病的寡核苷酸靶標的濃度為500nM，所述的6條寡核苷酸修飾的金納米粒子標記物的濃度為3nM；

步驟(4)中用所述的DNA微陣列芯片對模擬Ⅱ型糖尿病的寡核苷酸靶標和Ⅱ型糖尿病實際樣品進行檢測、及再用6條寡核苷酸修飾的金納米粒子標記物對檢測結果進行標記的反應溫度均為30℃；

步驟(4)中所述的模擬Ⅱ型糖尿病的寡核苷酸靶標序列分別為：

T₁：TTATAACTACGAGCAGTATGTAAGAGAG,

T_1A:TTATAACTACCAGCAGTATGTAAGAGAG，

T₂：TTTCATAAGCACCCGAGAAGGTTTAAAT，

T_2A:TTTCATAAACACCCGAGAAGGTTTAAAT，

T₃：TGCCCCACGACTTAGATGAAACCAGGAA，

T_3A：TGCCCCACTACTTAGATGAAACCAGGAA，

T₄：GTATCGTTCTGCTGTCATTGCATCAAGT，

T_4A：GTATCGTTCTGCTGTCATTGCATCAAGT，

T₅：TTTAGTTTTCCCATGACAGTAAGTCTAT，

T_5A：TTTAGTTTTCTCATGACAGTAAGTCTAT，

T₆：TTTTTAGATACTATATAATTTAATTGCC，

T_6A：TTTTTAGATATTATATAATTTAATTGCC；

步驟(4)中所述：

用所述的DNA微陣列芯片對模擬Ⅱ型糖尿病的寡核苷酸靶標進行檢測時，所述模擬Ⅱ型糖尿病的寡核苷酸靶標T₁、T₂、T₃、T₄、T₅、T₆、T_1A、T_2A、T_3A、T_4A、T_5A和T_6A的濃度分別為：0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、500和1000nM，寡核苷酸探針P₁、P₂、P₃、P₄、P₅、P₆、P_1A、P_2A、P_3A、P_4A、P_5A和P_6A的點樣濃度均為30μM；

用所述DNA微陣列芯片對Ⅱ型糖尿病實際樣品進行檢測時，實際樣品的濃度分別為：0.5、1、5和10nM，寡核苷酸探針P₁、P₂、P₃、P₄、P₅、P₆、P_1A、P_2A、P_3A、P_4A、P_5A和P_6A的點樣濃度均為30μM；

在步驟(4)之后還包括如下步驟：

將所述DNA微陣列芯片與1mL銀增強溶液反應8min；

所述銀增強溶液為硝酸銀溶液與氫醌溶液的混合溶液，硝酸銀溶液與氫醌溶液的體積比為1:1。