[發明專利]梅毒螺旋體特異性抗體化學發光檢測試劑盒及其制備方法

在審

• 申請號: 201410628360.6
• 申請日: 2014-11-10
• 公開（公告）號: CN104316681A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發明（設計）人: 劉莉莉;楊天賜;童曼莉;張惠林;林麗蓉;張長弓
• 申請（專利權）人: 廈門大學附屬中山醫院;廈門市波生生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/571
• 分類號: G01N33/571;G01N33/535;G01N21/76
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應森

技術領域

本發明涉及梅毒螺旋體，尤其是涉及采用微孔反應板化學發光方法進行梅毒螺旋體特異性抗體檢測的梅毒螺旋體特異性抗體化學發光檢測試劑盒及其制備方法。

背景技術

梅毒是由梅毒螺旋體引起的性傳播性疾病，近年來在國內的發病率逐年上升，梅毒的防控已列為我國公共衛生服務的主要任務之一。

梅毒螺旋體不能體外培養，而直接病原學暗視野顯微鏡檢查陽性率不高，血清學實驗包括心磷脂抗體和特異性抗體檢測，心磷脂抗體的假陽性率高，靈敏度低。而梅毒特異性抗體檢測方法包括梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗(TPPA)、熒光梅毒螺旋體抗體吸收試驗(FTA-ABS)及免疫印跡法(Western-blot)等方法進行檢測，其特異性均較高。化學發光免疫分析是利用抗原抗體反應的高度特異性、高親和力，以及酶促化學發光反應高效率而建立起來的一種超敏感性微量定量測定技術，可以大大提高操作的便捷性，可稱之為當今最敏感、特異的抗體免疫定量測試方法，有著良好應用前景，目前多數化學發光方法采用磁珠作為反應固相，其反應的重復性受磁珠顆粒的大小和均勻的程度影響較大。

中國專利CN101881772A公開一種基于流式微球載體技術的梅毒螺旋體(TP)抗體檢驗試劑盒及其制備和檢測方法，具體包括用TP重組抗原包被高聚分子微球，用牛血清白蛋白封閉空白結合點，制成特異性TP探針-高聚分子微球；與待測標本共培養捕獲TP抗體，洗滌離心除去未結合的TP抗體，再加入熒光標記的抗人IgG或IgM抗體；使用流式細胞儀檢測微球的熒光強度，對受測抗體進行定性或定量分析。

發明內容

本發明的目的在于提供采用微孔反應板化學發光方法進行梅毒螺旋體特異性抗體檢測的梅毒螺旋體特異性抗體化學發光檢測試劑盒及其制備方法。為梅毒特異性抗體檢測提供高靈敏度、高精密度的檢測的技術手段。

所述梅毒螺旋體特異性抗體化學發光檢測試劑盒設有外包裝盒、堿性磷酸酶標記重組抗原瓶、發光底物瓶、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對照品瓶、梅毒螺旋體特異性陽性對照品瓶、洗滌液瓶和重組抗原包被微孔板；堿性磷酸酶標記重組抗原瓶、發光底物瓶、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對照品瓶、梅毒螺旋體特異性陽性對照品瓶、洗滌液瓶和重組抗原包被微孔板設在外包裝盒內；堿性磷酸酶標記重組抗原瓶內裝有堿性磷酸酶標記重組抗原、發光底物瓶內裝有發光底物、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對照品瓶內裝有梅毒螺旋體特異性抗體陰性對照品、梅毒螺旋體特異性陽性對照品瓶內裝有梅毒螺旋體特異性陽性對照品、洗滌液瓶內裝有洗滌液。

所述梅毒螺旋體特異性抗體化學發光檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

1)制備梅毒螺旋體特異性重組抗原：

采用基因克隆技術，PCR擴增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達，得梅毒螺旋體特異性抗原TPN17和TPN47；

2)制備重組抗原包被微孔板

將步驟1)中的梅毒螺旋重組抗原TPN17和TPN47用包被緩沖液稀釋至20μg/mL，以每孔0.1mL加入微孔板中，4℃包被24h；取出抗原板，風干；用0.01mmol/L?pH7.4磷酸鹽緩沖液配制的1.0％脫脂奶粉，每孔0.2mL，4℃封閉24h，取出用磷酸鹽緩沖液洗滌5次，室溫風干、消毒，制備重組抗原包被微孔板，密封備用；

3)重組抗原的堿性磷酸酶標記

堿性磷酸酶經過碘酸鈉活化，分別與步驟1)重組抗原分子的-NH2偶聯，形成堿性磷酸酶標記重組抗原；

4)發光底物制備

人工合成金剛烷胺類發光底物(AMPPD)及其增強劑，均經無菌過濾，制備發光底物工作液；

5)洗滌液制備

洗滌液為溶有Tween-20的磷酸鹽緩沖液，其中Tween-20的終濃度為0.01％；

6)對照品

梅毒螺旋體特異性抗體陰性對照品：由非梅毒感染的健康人群血清配制而成；

梅毒螺旋體特異性陽性對照品：梅毒患者的特異性抗體陽性血清配制而成；

7)制備梅毒螺旋體特異性抗體化學發光檢測試劑盒

將堿性磷酸酶標記重組抗原、發光底物、洗滌液、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對照品、梅毒螺旋體特異性抗體陽性對照品分別裝入瓶內，再將堿性磷酸酶標記重組抗原瓶、發光底物瓶、梅毒螺旋體特異性抗體陰性對照品瓶、梅毒螺旋體特異性陽性對照品瓶、洗滌液瓶和重組抗原包被微孔板裝入外包裝盒，組成梅毒螺旋體特異性抗體化學發光檢測試劑盒。

在步驟7)中，所述瓶可采用聚乙烯瓶。