[發明專利]利用多能干細胞制備神經前體細胞的方法

有效

• 申請號: 201410625288.1
• 申請日: 2014-11-07
• 公開（公告）號: CN105624116B
• 公開（公告）日: 2020-04-07
• 發明（設計）人: 樂衛東;楊娟;唐宇
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院
• 主分類號: C12N5/0797
• 分類號: C12N5/0797
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

本發明涉及利用多能干細胞制備神經前體細胞的方法。首次揭示一種可顯著提高多能干細胞向神經前體細胞分化效率的方法，通過采用組蛋白去乙酰化酶抑制劑作為誘導劑來提高多能干細胞分化為神經前體細胞的效率。此外，還揭示了通過在多能干細胞中下調HDAC3或SMRT的表達或活性的方式來提高分化效率的方法。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，更具體地，本發明涉及利用多能干細胞制備神經前體細胞的方法。

背景技術

人多能干細胞(hPSCs；包括人胚胎干細胞hESCs和人誘導多能干細胞hiPSCs)是研究各種疾病尤其是神經退行性疾病的良好模型。由其分化的神經前體能夠進一步分化為神經元和膠質細胞，對神經退行性疾病的疾病機制研究，藥物篩選及疾病標志物的篩查，細胞移植治療有很重要的作用。

目前人多能干細胞的神經分化方法主要有三種：

第一種方法是類胚體(embryoid body，EB)誘導。將培養的hESC或hiPSC消化為團塊懸浮培養將形成EB。EB包含三個胚層的細胞，具有向各類細胞繼續分化的能力。EB貼壁培養，逐漸會出現神經花環結構(rosette)的細胞團，將這類細胞挑出繼續培養，則可得到神經前體。這些神經前體可增殖，并能向神經元，膠質細胞分化。在特定因子的誘導下可分化為特定類型的神經元。EB誘導方法的缺點是神經元分化效率低，EB的形成效率依賴于細胞狀態，并不是每株細胞每次分化都能獲得很多EB。而且EB包涵三個胚層的細胞，最后挑出的神經花環也是神經類細胞和膠質細胞的混合體，有很多非神經類的細胞。這些都會影響最后神經分化的效率。

第二種分化方法是與基質細胞共培養。在發育過程中神經元的分化由很多信號通路決定，參與的細胞并不是只有神經元本身，如膠質細胞，骨髓基質細胞等能分泌很多因子促進神經元的分化。常用的基質細胞有PA6，MS5，也可用原代膠質細胞。分化開始時先在培養皿底下鋪一層基質細胞，再將hESC或hiPSC種上去，在一定培養液條件下可有導出成熟神經元。這種分化方法的缺點是，基質細胞分泌的因子是不確定的，也不穩定，所以不同批次分化效率都可能會有差異。而且不能獲得神經前體。

第三種分化方法是單層細胞培養法(adherent monolayer culture system)。將hESC或hiPSC單層貼壁培養，通過添加不同誘導因子來誘導神經分化。這種方法是通過用各種細胞因子和小分子如shh，FGF8，RA，SB431542等來激活神經類細胞分化的通路或阻斷非神經類細胞的分化通路的作用來達到促進神經分化的目的。

人多能干細胞的神經分化對神經退行性疾病的研究提供重要的模型，獲得盡可能多的神經分化細胞對于科學及臨床研究都很有必要。然而，上述人多能干細胞向神經分化的方法均存在一些缺點，包括效率低，耗時長，所得細胞不純等。因此，本領域還有必要開發改進的技術，來提高分化效率或提高細胞純度。

發明內容

本發明的目的在于提供利用多能干細胞制備神經前體細胞的方法。

在本發明的第一方面，提供一種制備神經前體細胞的方法，所述方法包括：

(1)以維甲酸(RA)和組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導培養多能干細胞，獲得神經球；和

(2)培養(1)獲得的神經球使之成熟，獲得神經前體細胞。

在一個優選例中，所述的組蛋白去乙酰化酶抑制劑包括：丁酸鈉(NaB)，丙戊酸鈉(VPA)或MGCD0103或其組合。

在另一優選例中，丁酸鈉的用量是：50μM-1mM；丙戊酸鈉的用量是50μM-3mM；MGCD0103的用量是0.1-3μM。

在另一優選例中，丁酸鈉的用量是60-200μM，如80μM，100μM，200μM，300μM。