[發明專利]一種固定化酶的制備方法

有效

• 申請號: 201410619223.6
• 申請日: 2014-11-05
• 公開（公告）號: CN104404021B
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發明（設計）人: 李長龍;周磊;劉新華;常桑;唐文彬
• 申請（專利權）人: 安徽工程大學
• 主分類號: C12N11/08
• 分類號: C12N11/08
• 代理公司: 蕪湖安匯知識產權代理有限公司34107
• 代理人: 張巧嬋

技術領域

本發明涉及納米纖維膜的制備領域，具體涉及一種固定化酶的制備方法。

背景技術

酶是一種重要的生物催化劑，具有催化效率高、專一性強、反應條件溫和等特點。在食品、釀造、醫藥等領域具有廣泛應用。由于酶的特殊性質，其高級結構對環境十分敏感，如對溫度、pH、有機溶劑、重金屬離子等因素，且反應后不能夠回收，使酶在工業應用中受到限制。

而固定化酶技術可以有效提高酶在極端條件下的穩定性和催化活性，同時易于回收再利用。目前，制備固定化酶的材料和方法有很多種，其中納米材料固定化酶因其高載酶量受到了研究者的親睞，尤其是一些具有多孔結構、大比表面積的載體材料有利于提高固定化酶的載酶量，并有利于底物向酶活性中心和產物向反應區域以外擴散和回收的難題。近年來，利用靜電紡絲制備納米纖維膜固定化酶成為一個新興研究熱點。

載體的良好生物相容性是酶固定化載體的必備條件之一。由于良好的生物相容性可以減少酶蛋白與載體間的非特異性相互作用，為固定化酶提供生物友好的微環境，從而提高固定化酶的催化效率。天然高分子材料無毒害，親水性好，具有適合酶催化反應的天然微環境，是目前固定化酶的首選材料。通常涂覆、吸附、自組裝、表面修飾來改善載體的生物相容性。

角蛋白是一種不溶性的纖維狀動物蛋白，廣泛存在于動物皮膚及皮膚附屬物中，如毛發、蹄、殼、爪、角、鱗片等。且角蛋白資源豐富、廉價易得。近幾年大量研究表明，角蛋白是一種生物相容性好且不被機體免疫排斥的優質生物醫用材料。

專利CN103993425一種聚己內酯-角蛋白復合納米纖維膜的制備方法，公開日期2014年8月20日，公開了通過靜電紡絲技術制備了聚己內酯-角蛋白復合納米纖維膜，為醫用敷料開發提供一種途徑。Huang等人利用膠原蛋白等生物大分子對聚(丙烯腈-丙烯酸)納米纖維膜進行表面改性，并固定化脂肪酶(Huang XJ,Yu AG,Jiang J,Pan C,Qian JW,Xu ZK,J.Mol.Catal.B:Enzym.2009,57:250-256)。

但是，上述技術在改善載體生物相容性和固定化酶存在工藝比較繁瑣、很難大規模生產和應用等缺點。

因此，有必要研制一種工藝簡單、生物相容性良好、有工業生產潛力的納米纖維膜，同時提高固定化酶的載酶量、催化穩定性和重復使用性。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供了一種固定化酶的制備方法，以角蛋白與聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)復合納米纖維膜為載體，制備得到的固定化酶有高的載酶量，催化穩定性好，重復使用性好。

本發明提供的一種固定化酶的制備方法，包括以下步驟：

(1)、將角蛋白與聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，完全溶解后，獲得紡絲液，注入靜電紡絲裝置中進行靜電紡絲，將獲得的復合納米纖維膜置于真空干燥箱中在25℃～40℃條件下干燥5～10h，即得到角蛋白與聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)復合納米纖維膜；

(2)、將角蛋白與聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)復合納米纖維膜浸入質量分數為3％～6％的戊二醛溶液中，25℃水浴震蕩1～4h，震蕩速度40～100r/min，取出后用蒸餾水沖洗，再浸入1～15mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞銨鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺的磷酸鹽緩沖液中震蕩活化1～4h，震蕩速度40～100r/min；取出后在pH為7的磷酸鹽緩沖液反復沖洗，得到活化后的角蛋白與聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)復合納米纖維膜；

(3)、將活化后的角蛋白與聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)復合納米纖維膜浸入濃度為0.4～1.0mg/ml酶的磷酸鹽緩沖液中，密閉后在4～25℃的恒溫條件下震蕩1～4h，震蕩速度為40～100r/min，取出，用磷酸鹽緩沖液反復沖洗5次，即可得到角蛋白與聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)復合納米纖維膜固定化酶。

步驟(1)中所述角蛋白與聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)的質量比為1:4-19；所述聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)的丙烯酸甲酯與丙烯酸質量比為4-19:1。

步驟(1)中所述紡絲液中角蛋白與聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)的總質量分數為26％～30％；靜電紡絲的條件控制為：電壓為14～20kV，紡絲流速為0.2～0.6ml/h、接受距離為10～25cm。

步驟(1)中所制備得到的角蛋白與聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)復合納米纖維膜的直徑為300～600nm。