[發(fā)明專利]表達(dá)四種抗性蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410618785.9
• 申請(qǐng)日: 2014-11-06
• 公開（公告）號(hào): CN104404081A
• 公開（公告）日: 2015-03-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張祿卿;鄭耀武;班路瑩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東北師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;A01K67/027
• 代理公司: 長(zhǎng)春市東師專利事務(wù)所 22202
• 代理人: 劉延軍;李榮武

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技術(shù)領(lǐng)域????

本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速獲得多種抗性的轉(zhuǎn)基因小鼠及多種抗性的MEF。

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背景技術(shù)

自1980年第一只轉(zhuǎn)基因小鼠誕生以來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了迅猛的發(fā)展。轉(zhuǎn)基因小鼠模型目前已經(jīng)成為基因功能研究的一個(gè)最重要工具。基因打靶技術(shù)作為諸多轉(zhuǎn)基因小鼠制備方法中的一種，倍受研究者的青睞。它是基于同源重組的原理，定點(diǎn)敲除、敲入或者進(jìn)行基因的突變而對(duì)小鼠的內(nèi)源基因進(jìn)行改造。基因打靶的受體細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)通常需要小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（Mouse?Embryonic?Fibroblast，MEF）來作為滋養(yǎng)層細(xì)胞。基因打靶之后需要抗性藥物的篩選才能獲得陽性克隆，尤其是近來研究者熱衷于一株干細(xì)胞的多基因連續(xù)打靶，這就需要兩種或者多種抗性的MEF來滿足實(shí)驗(yàn)需求。目前商品化的4種抗性的MEF是從Jackson實(shí)驗(yàn)室DR-4小鼠中分離的。DR-4小鼠是將4個(gè)轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)全部配成純和來維系的，且抗性表達(dá)不高。因此，傳統(tǒng)獲得多種抗性轉(zhuǎn)基因小鼠的方法已經(jīng)不能滿足研究的要求。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（transgenic?animals）是通過人工的方法，將外源基因?qū)雱?dòng)物基因組內(nèi)使之與動(dòng)物基因組整合穩(wěn)定表達(dá)并遺傳給后代的動(dòng)物^[1]。目前已經(jīng)成功制備了很多轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，比如：牛、羊、雞、豬、魚、兔、鼠、果蠅等。轉(zhuǎn)基因技術(shù)首先是在小鼠上建立起來的，也因此小鼠成為生命科學(xué)發(fā)展的一個(gè)很得力的動(dòng)物模型。自1980年第一只轉(zhuǎn)基因小鼠誕生以來，很多研究者紛紛開展轉(zhuǎn)基因小鼠研究工作，轉(zhuǎn)基因小鼠的制備方法由最開始的原核注射到如今已經(jīng)產(chǎn)生了很多種制備轉(zhuǎn)基因小鼠的方法。但是目前制備轉(zhuǎn)基因小鼠模型主要有兩種基本方法：一種是轉(zhuǎn)基因，另一種是基因打靶。

轉(zhuǎn)基因是將外源基因引入小鼠基因組內(nèi)。主要有原核注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒侵染法（慢病毒侵染法）以及胚胎干細(xì)胞法。這3種方法可以實(shí)現(xiàn)將外源基因轉(zhuǎn)移到小鼠基因組內(nèi)。原核注射法是直接將克隆的載體通過顯微注射的方法注射到小鼠的受精卵原核中，實(shí)現(xiàn)克隆基因的整合表達(dá)。這是非常經(jīng)典的一種轉(zhuǎn)基因方法。它的優(yōu)點(diǎn)是可以有效的注射大小可達(dá)幾個(gè)Kb到幾百個(gè)Kb的外源DNA片段，而且可以有效的整合到小鼠的基因組中。當(dāng)然，它的缺點(diǎn)毋庸置疑就是原核注射法它的效率不高，一般需注射500-600個(gè)受精卵才能得到3-4個(gè)首建鼠，甚至得不到。即使有了首建鼠，即外源基因已經(jīng)整合到小鼠的基因組內(nèi)，但是往往就會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠在后期不表達(dá)。另一種是逆轉(zhuǎn)錄病毒侵染法，它可以通過侵染小鼠著床前胚胎細(xì)胞或者著床后胚胎細(xì)胞，將外援的DNA轉(zhuǎn)移到小鼠基因組中。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，很多通過逆轉(zhuǎn)錄病毒侵染法得到的轉(zhuǎn)基因小鼠的轉(zhuǎn)基因片段因發(fā)生甲基化而不表達(dá)。慢病毒因克服了基因沉默而優(yōu)于逆轉(zhuǎn)錄病毒，但慢病毒載體侵染法對(duì)外源DNA片段的大小有限制而且整合的外源基因不是集中分布的，所以我們不能通過慢病毒載體侵染法在基因組的某個(gè)部位插入多個(gè)拷貝的外源基因?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)基因的高表達(dá)。還有一種方法是胚胎干細(xì)胞法，也被稱為是ES細(xì)胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因。這一技術(shù)是建立在胚胎干細(xì)胞技術(shù)的基礎(chǔ)之上的。胚胎干細(xì)胞法有很多優(yōu)點(diǎn)，如它可以在載體構(gòu)建的時(shí)候引入一個(gè)正篩選標(biāo)記基因，在細(xì)胞轉(zhuǎn)染之后可以在培養(yǎng)皿中篩選得到外源基因表達(dá)量高的細(xì)胞株。而且ES細(xì)胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因傾向于單拷貝整合，那么可以在幾百個(gè)克隆中選出單拷貝、普遍高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因ES細(xì)胞系。將這些細(xì)胞株注射到小鼠囊胚中，得到嵌合體再傳代極有可能是外源基因表達(dá)量高的轉(zhuǎn)基因小鼠。一定程度上減少了通過原核注射得到的轉(zhuǎn)基因小鼠，在后期對(duì)首建鼠（Founder）轉(zhuǎn)基因表達(dá)高低篩選的工作量。胚胎干細(xì)胞法在載體的構(gòu)建上還可以引入報(bào)告基因、loxP等位點(diǎn)，使得ES細(xì)胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因可以在時(shí)空表達(dá)上受到一定的控制。胚胎干細(xì)胞法也有缺點(diǎn)，它在技術(shù)上要求更高。比如通過這種方法制備的轉(zhuǎn)基因一定是在ES細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)上相當(dāng)熟練，因?yàn)镋S細(xì)胞在培養(yǎng)的過程中很容易因細(xì)胞分化而失去了全能性。