[發(fā)明專利]一種固定化碳酸酐酶及其制備方法

有效

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• 申請日: 2014-11-05
• 公開（公告）號: CN104404024B
• 公開（公告）日: 2017-10-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 祝俊;余允東;張敏;陳亭亭;龍輝;汪浩;周曉青;張燕;陳風(fēng)義
• 申請（專利權(quán)）人: 上海立足生物科技有限公司
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14;C12N11/08
• 代理公司: 南京申云知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)32274
• 代理人: 邱興天

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于固相化酶技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種固定化碳酸酐酶及其制備方法。

背景技術(shù)

酶的固定化是指通過化學(xué)、物理、生物方法，利用載體將酶限制或束縛在特定區(qū)域內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的一種酶工程技術(shù)。酶的固定化技術(shù)有利于酶回收及連續(xù)化運(yùn)作從而降低生產(chǎn)成本，因此成為近年來酶工程領(lǐng)域最為活躍的研究重點(diǎn)之一。

磁性納米顆粒是一種利于分離和再利用的固定化載體，在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛。目前磁性納米顆粒載體主要通過殼聚糖和瓊脂糖包裹磁性納米核達(dá)到改性修飾的目的。然而這種方法制備的磁性納米顆粒固定化載體，由于采用包埋作用將酶分子包埋于載體內(nèi)部，導(dǎo)致酶的催化活性結(jié)構(gòu)受到載體的阻礙，對酶活力會(huì)造成影響，和游離酶相比，活力大幅度降低。

碳酸酐酶，是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種金屬蛋白，能夠高效催化二氧化碳水化和去水化反應(yīng)。固定化的碳酸酐酶在環(huán)境保護(hù)、生物質(zhì)能源、食品儲存工業(yè)、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域都有重要應(yīng)用。目前碳酸酐酶的固定化，主要采用離子交換作用力、物理吸附力或包埋法等方法與微米級以上固相多孔性顆粒結(jié)合。其中，微米級以上固相多孔性顆粒尺寸過大，固定化酶分散性弱，影響外部傳質(zhì)阻力，導(dǎo)致催化效率低；離子交換作用力，結(jié)合的碳酸酐酶過少；物理吸附力，作用力過弱，結(jié)合不牢固，導(dǎo)致多次使用后生物酶流失，批次使用效果不穩(wěn)定；包埋法，碳酸酐酶的活性位點(diǎn)受到載體的阻礙，影響內(nèi)部傳質(zhì)阻力，導(dǎo)致催化效率低。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷，本發(fā)明的目的是提供了一種固定化碳酸酐酶，采用共價(jià)鍵將如碳酸酐酶的生物酶與磁性納米顆粒結(jié)合，形成固定化生物酶，具有酶催化效率高、生物酶不易脫落、操作穩(wěn)定性高等特點(diǎn)。本發(fā)明的另一目的是提供一種上述固定化碳酸酐酶的制備方法。

技術(shù)方案：為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種固定化碳酸酐酶，包括磁性納米顆粒、富醛基復(fù)合材料以及碳酸酐酶；所述富醛基復(fù)合材料包裹在磁性納米顆粒表面形成富醛基殼，所述富醛基殼的表面醛基與碳酸酐酶通過共價(jià)鍵結(jié)合；其中，磁性納米顆粒平均粒徑為5~30nm，富醛基殼的平均厚度為5~20nm。

所述磁性納米顆粒為納米鐵氧化物或納米鈦氧化物。

所述富醛基復(fù)合材料包括兩層，從內(nèi)到外依次為硅烷交聯(lián)劑層和多醛基化合物層。

所述碳酸酐酶為α型或β型碳酸酐酶。

所述固定化碳酸酐酶，每克固定化碳酸酐酶包含碳酸酐酶50~300mg。

一種所述固定化碳酸酐酶的制備方法，包括以下步驟：

1）制備磁性納米顆粒；

2）取磁性納米顆粒和硅烷交聯(lián)劑均勻分散于有機(jī)溶劑中，低溫低速攪拌，獲得包覆有硅烷交聯(lián)劑的磁性納米顆粒；

3）取包覆有硅烷交聯(lián)劑的磁性納米顆粒，均勻分散于多醛基化合物的弱堿性緩沖液中，去除緩沖液，獲得醛基功能化的磁性納米顆粒；

4）取醛基功能化的磁性納米顆粒，加入待固定化的碳酸酐酶溶液，攪拌混合進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)，即制得固定化碳酸酐酶。

步驟2）中，所述的硅烷交聯(lián)劑為氨丙基三乙氧基硅烷或氨丙基三甲氧基硅烷，所述有機(jī)溶劑為無水乙醇，將磁性納米顆粒與硅烷交聯(lián)劑超聲分散后，再將分散液加入到有機(jī)溶劑中，攪拌分散，從而使分散液與有機(jī)溶劑充分混勻，采用磁性分離去除有機(jī)溶劑。

步驟3）中，所述的多醛基化合物為戊二醛、丁二醛或丙二醛，采用磁性分離去除有機(jī)溶劑。

步驟4）中，所述醛基功能化的磁性納米顆粒與碳酸酐酶過共價(jià)鍵結(jié)合形成固定化碳酸酐酶；所述碳酸酐酶溶液濃度為1~5mg/mL，碳酸酐酶與富醛基復(fù)合材料包裹的磁性納米顆粒的質(zhì)量比為1:2~10。

步驟4）中，所述共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)條件為25~30℃，搖床混合2~5h，搖床轉(zhuǎn)速為120~200r/min。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1）本發(fā)明采用共價(jià)鍵將磁性納米顆粒載體和生物酶結(jié)合，獲得的固定化碳酸酐酶，具有納米級粒徑，使得固定化酶在催化體系中的分散性優(yōu)于微米級以上的固定化酶。

2）本發(fā)明提供的固定化碳酸酐酶，具有超順磁性，使得固定化酶的重復(fù)使用性、操作穩(wěn)定性都優(yōu)于游離的碳酸酐酶。

3）本發(fā)明提供的固定化碳酸酐酶，采用醛基功能化修飾的磁性納米顆粒與碳酸酐酶通過共價(jià)鍵結(jié)合，使得固定化碳酸酐酶物理穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性都優(yōu)于游離的碳酸酐酶，應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)能大幅提高生產(chǎn)效率，同時(shí)降低生物酶的使用成本。

附圖說明

圖1是固定化碳酸酐酶的結(jié)構(gòu)示意圖；