[發明專利]酶法制備(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯

在審

• 申請號: 201410613335.0
• 申請日: 2014-11-04
• 公開（公告）號: CN104328148A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發明（設計）人: 竺偉;陳加利;張文明;吳會
• 申請（專利權）人: 尚科生物醫藥（上海）有限公司
• 主分類號: C12P7/62
• 分類號: C12P7/62;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于制藥工業生物技術領域，具體涉及一種酶法制備(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯的方法。

背景技術

(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯是降膽固醇他汀類藥物羅蘇伐他汀(Rosuvastatin)的關鍵手性中間體，該中間體的合成技術一直以來受到廣泛的研究與關注。目前文獻報道的制備方法主要有化學法和生物法。

化學法生產(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯是利用易燃的硼烷類衍生物在-70℃下將(S)-6-氯-5-羥基-3-氧代己酸叔丁酯不對稱還原得到。該工藝需要極端低溫和無水無氧的反應條件，能耗嚴重，難以實用化(Angew.Chem.Int.Ed.,2000,39,4306-4308)。

生物催化技術以具有底物專一性強、催化效率高、反應條件溫和、反應步驟簡便及環境污染小等特點，被廣泛用于制備他汀類手性側鏈前體。

已報道的制備(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯的生物法中，大部分均需要同時使用酮還原酶和葡萄糖脫氫酶，而且都是分開表達、分開加料的，這就使得發酵次數增加、成本提高，同時也影響生產的使用和效率(US7879585B)。

發明內容

為了克服現有技術存在的上述缺陷，本發明公開了一種酶法制備(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯的方法。

具體工藝路線如下所示：

為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：

1)、將能表達用于還原(S)-6-氯-5-羥基-3-氧代己酸叔丁酯到(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯的酮還原酶基因與能表達葡萄糖脫氫酶的基因通過生物技術重組到同一質粒并裝載到基因工程菌中，所得基因工程菌通過發酵獲得大量含酮還原酶(KRED)與葡萄糖脫氫酶(GDH)的全細胞；

2)、將上述共表達全細胞、(S)-6-氯-5-羥基-3-氧代己酸叔丁酯、輔因子、葡萄糖和緩沖液按一定比例混合反應，在pH＝5～8、溫度為20～45℃下反應1-48小時；反應結束后離心去除細胞，所得清液用有機溶劑萃取，萃取液濃縮后即得(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯，可直接用于下游中間體的制備。

本發明方法用于催化反應的共表達全細胞濃度為10～300g/L，其中優選為60～90g/L；(S)-6-氯-5-羥基-3-氧代己酸叔丁酯濃度為10-300g/L，優選為200～250g/L；輔因子濃度為0.01～1.0g/L；葡萄糖濃度為10～300g/L，優選為200～250g/L；緩沖液濃度為10～100mM/L，優選為80mM/L。反應結束后反應液用有機溶劑萃取、濃縮后得到轉化率大于95％、光學純度大于99.9％的目標產物。

進一步說，共表達全細胞是由能同時表達酮還原酶與葡萄糖脫氫酶重組基因的大腸桿菌或酵母菌通過發酵培養得到，其中優選為大腸桿菌。

進一步說，利用發酵得到的共表達全細胞直接進行催化反應，無需破碎和分離純化。

進一步說，重組基因由表達酮還原酶基因(在本發明中使用的酮還原酶基因序列來源于釀酒酵母Saccharomyces?cerevisiae)和表達葡萄糖脫氫酶基因(在本發明中使用的葡萄糖脫氫酶基因序列來自于枯草芽孢桿菌Bacillus?subtilis)重組而成。

進一步說，反應pH＝5～8，優選為pH＝7；反應溫度為20～45℃，優選為30℃。

進一步說，輔因子為NAD、NADH、NADP和NADPH的任意一種或它們的組合，其中優選為NADP。

進一步說，輔因子為NADP，可以是凍干粉或水溶液，其中優選為水溶液。

進一步說，緩沖液選自磷酸鹽緩沖液或三乙醇胺緩沖液，其中優選為三乙醇胺緩沖液。

進一步說，有機溶劑為二氯甲烷或乙酸乙酯，其中優選為乙酸乙酯。

與現有技術相比，本發明操作過程簡單、生產效率高、環境友好、生產成本較低且反應轉化率及產物光學純度高，具有良好的工業應用價值。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明的技術內容作進一步的闡述，其目的是為了更好的理解本發明的內容，但本發明的保護范圍不限于此。

實施例1?共表達重組大腸桿菌和全細胞的制備