[發明專利]一種檢測Von Hippel-Lindau綜合征相關基因突變的試劑盒

在審

• 申請號: 201410613208.0
• 申請日: 2014-11-05
• 公開（公告）號: CN104388551A
• 公開（公告）日: 2015-03-04
• 發明（設計）人: 劉哲
• 申請（專利權）人: 百世諾（北京）醫療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及醫學診斷和生物技術，涉及一種檢測Von?Hippel-Lindau綜合征相關基因突變的體外診斷試劑盒，是一種應用于新一代測序平臺技術的一種Von?Hippel-Lindau綜合征相關基因突變的試劑盒。

技術背景

Von?Hippel-Lindau(VHL)綜合征是由抑癌基因VHL突變所致的一種遺傳性腫瘤綜合征，表現為多種惡性或良性腫瘤，最常見的包括視網膜和中樞神經系統血管母細胞瘤、腎透明細胞癌、嗜鉻細胞瘤、胰腺腫瘤等。

VHL綜合征呈常染色體顯性遺傳，發病率為每年1/36000，VHL是目前已知的唯一致病基因。該病發病年齡早，外顯率高，至60歲時外顯率達97％，約80％的基因突變為家族遺傳性，20％為新發突變。

VHL綜合征的臨床表現及疾病嚴重程度具有很大差異性，即使在攜帶同一突變的患者也是如此。

中樞神經系統血管母細胞瘤是VHL的典型病變，其中80％為腦部病變，20％為脊髓病變，且通常伴有囊腫，患者臨床癥狀與腫瘤發生部位有關，如小腦幕下腫瘤可出現頭痛、嘔吐、共濟失調等。視網膜血管母細胞瘤通常為VHL的首發病變，平均發現年齡為25歲，患者可無癥狀或表現為視野缺損，或由于視網膜剝脫、出血而出現視力喪失。腎臟病變主要包括腎囊腫和腎細胞癌(尤其是腎透明細胞癌)，腎細胞癌是VHL綜合征患者死亡的主要原因。嗜鉻細胞瘤可發生在單側或雙側腎上腺，表現為持續性、陣發性高血壓或完全無癥狀。胰腺病變為單純性囊腫，很少導致內分泌或外分泌不足，但發生在胰腺頭部的囊腫可能會引起梗阻。內淋巴囊腫瘤則可導致不同程度的耳聾。

對于Von?Hippel-Lindau綜合征綜合征的鑒別診斷傳統的方法主要依靠生化檢查和影像學檢查。這些手段存在很大的缺點：

1.檢查種類多；

2.靈敏度和特異度低；

3.易受藥物和精神狀況等因素的影響；

4.檢測時間要求苛刻；

對于疑似VHL、VHL相關腫瘤患者、根據嚴格臨床診斷標準無法確診的VHL癥狀者均可通過基因檢測進行診斷，發現致病突變即可確診。對于存在致病突變的家族，應進行基因篩查以早期發現無癥狀攜帶者。

另外，對于無癥狀的致病突變攜帶者，應進行常規的隨訪以及時發現病變，早期進行臨床干預，改善預后。

基因診斷的優勢在于：

1.方便，安全，快捷：僅抽取2-4毫升血；

2.任何時間都可以檢查；

3.不限制飲食，服藥，任何身體狀況都可以檢測；

4.相比反復，多項傳統檢查，更為經濟；

5.發病前，疾病極早期診斷的唯一方式；

6.源頭確診，一次檢測，終身受益。

這一切都揭示了基因診斷在臨床上有巨大的應用前景。

近年，大規模DNA平行測序平臺(massively?parallel?DNA?sequencing?platform)已經發展為主流的測序技術，這項測序技術的出現不僅令DNA測序費用降到了以前的百分之一，還讓基因組測序這項以前專屬于大型測序中心的“特權”能夠被眾多研究人員分享。

但是直接使用大規模DNA平行測序平臺檢測的成本目前仍然令個人難以承受。本發明可以同時把多個甚至幾十病人的Von?Hippel-Lindau綜合征相關基因精確的選擇性捕獲，然后用于大規模測序平臺，可以極大地降低基因診斷的成本，使之廣泛應用于臨床成為可能。

發明內容

本發明的目的是，提供一種檢測Von?Hippel-Lindau綜合征相關基因突變的目標捕獲再測序的試劑盒。該試劑盒提高了基因捕獲的通量和基因平行測序的通量，操作簡便、成本低。

為實現上述目的，本發明采用捕獲目的VHL部外顯子片段以及鄰近50bp的非編碼區的探針；用于擴增待測片段的通用引物；測序接頭序列；緩沖液；dNTP；高保真聚合酶；鏈霉素磁珠。本發明采用的技術方案是：一種新的目標捕獲再測序方法，包括以下步驟：

A.設計并制備用于捕獲Von?Hippel-Lindau綜合征相關基因突變的探針。并將這些探針結合在磁珠、薄膜或者玻片上。探針序列見序列表。

B.將待測基因DNA樣品分別片段化至200-400bp，然后將末端補平，加入的ATP使片段兩端引入粘性末端。

C.分別加入Illumina公司DNA?Sample?Prep?Kit中設計好的一端帶有標簽序列的接頭序列片段，加入連接酶，使每個片段都與的一對接頭連接，形成新的片段。