[發(fā)明專利]ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410612840.3
• 申請日: 2014-11-04
• 公開（公告）號: CN104327157A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 管驍;劉靜;程文宇
• 申請（專利權(quán)）人: 上海理工大學(xué);上海海事大學(xué)
• 主分類號: C07K5/062
• 分類號: C07K5/062;C07K5/083;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;C07K1/20;C12P21/06
• 代理公司: 上海德昭知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31204
• 代理人: 郁旦蓉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于功能性食品配料制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種ACE?C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的制備方法。?

背景技術(shù)

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin?I-converting?enzyme,ACE,EC3.4.15.1)是心血管疾病治療中的重要靶標(biāo)之一。通過腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin?system,RAS)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(kallikrein-kinin?system,KKS)，ACE對血壓、電解質(zhì)和體液平衡、心血管系統(tǒng)發(fā)育和結(jié)構(gòu)重塑等方面起著重要的調(diào)節(jié)作用，ACE抑制劑(ACEI)現(xiàn)已成功地作為治療高血壓的一線藥物應(yīng)用于臨床。?

ACE已被證實(shí)是一種肽鏈被高度糖基化的含鋅二肽羧酶，可將無活性的AngⅠ轉(zhuǎn)化為具有血管收縮活性的AngⅡ，同時還能催化具有舒張血管作用的舒緩激肽(bradykinin,BK)的降解，因此體內(nèi)ACE活性過高，易導(dǎo)致高血壓。ACE分子中存在著兩個同源程度較高的結(jié)構(gòu)域，即C-結(jié)構(gòu)域和N-結(jié)構(gòu)域，但它們在底物特異性、催化能力、氯離子激活以及發(fā)揮的生理功能方面存在著較大差別。?

長期以來受限于對ACE的分子結(jié)構(gòu)與作用機(jī)理的認(rèn)知水平，對ACE抑制活性的研究大多還未上升到分子結(jié)構(gòu)域選擇性水平，當(dāng)前所認(rèn)識到的ACE抑制肽多為結(jié)構(gòu)域混合型ACE抑制肽。近年來的研究成果表明：選擇性抑制ACE?C-結(jié)構(gòu)域活性不僅可有效調(diào)節(jié)機(jī)體血?壓，而且可保留N-結(jié)構(gòu)域?qū)κ婢徏る牡乃饣钚?，從而避免舒緩激肽在組織中的過度累積而導(dǎo)致干咳、水腫等副作用，因此ACE?C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽比當(dāng)前普遍應(yīng)用的結(jié)構(gòu)域混合型ACE抑制肽更安全且無副作用。目前為止，國內(nèi)外尚未見食源性ACE?C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的研究報道。?

目前對各種食源性活性肽的常規(guī)篩選方法為：間歇酶解→色譜分離→活性檢測→再分離→再活性檢測，直至得到純活性肽組分。間歇式酶解方式盡管操作簡便，反應(yīng)易于控制，但缺點(diǎn)是生產(chǎn)效率較低、酶使用成本高、不同批次產(chǎn)品品質(zhì)不穩(wěn)定等；另一方面，采用多種色譜聯(lián)用技術(shù)篩選酶解產(chǎn)物，不僅過程繁瑣耗時，難以實(shí)現(xiàn)快速、高通量篩選目的，而且肽回收率低。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是為解決上述問題進(jìn)行的，基于ACE?C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽相對分子質(zhì)量較小，且與ACE?C-結(jié)構(gòu)域活性位點(diǎn)存在較強(qiáng)非共價相互作用這一基本科學(xué)理論，以燕麥分離蛋白為原料，采用酶膜耦合聯(lián)用高特異性親和色譜技術(shù)進(jìn)行ACE?C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的高效制備與篩選。?

為解決上述問題，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：?

本發(fā)明提供了ACE?C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽，用于抑制ACE中C-結(jié)構(gòu)域活性，其特征在于：ACE?C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的序列為Gly-Tyr以及Ile-Arg-Pro中的任意一種。?

本發(fā)明提供了一種ACE?C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：以燕麥分離蛋白為原料，?

步驟1，配制質(zhì)量濃度為5％-10％燕麥分離蛋白溶液，并調(diào)節(jié)溶液的pH值為8.0～8.5，置于酶膜反應(yīng)器的反應(yīng)罐中，溫度控制在40℃～50℃，按酶/底物(質(zhì)量比)為1.0％～3.0％在蛋白溶液中加入胰蛋白酶，開啟循環(huán)泵，開始酶膜反應(yīng)，收集膜透過液，得到燕麥蛋白水解產(chǎn)物；?

步驟2，將步驟1中的燕麥蛋白水解產(chǎn)物干燥后溶解于碳酸氫銨溶液中，在親和色譜柱上進(jìn)行親和吸附，至濾出物在214nm處出現(xiàn)最大吸收并趨于平穩(wěn)為止；?

步驟3，對步驟2中的親和色譜柱進(jìn)行洗脫，得到目標(biāo)肽溶液；?

步驟4，對步驟3中的目標(biāo)肽溶液進(jìn)行濃縮、分離純化、序列解析以及抑制活性驗(yàn)證，得到ACE?C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽。?

本發(fā)明提供的ACE?C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的制備方法，還可以具有這樣的特征：酶膜反應(yīng)器中的膜為超濾膜或納濾膜，超濾膜或納濾膜的截留分子量為6000Da～10000Da，過濾壓力為0.8～1.0Mpa。?

本發(fā)明提供的ACE?C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的制備方法，還可以具有這樣的特征：酶膜反應(yīng)過程中，利用0.1mol/L的NaOH溶液進(jìn)行滴定，控制酶解液pH為8.0～8.5。?

本發(fā)明提供的ACE?C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的制備方法，還可以具有這樣的特征：酶膜反應(yīng)結(jié)束后，對得到的燕麥蛋白水解產(chǎn)物進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥的進(jìn)風(fēng)溫度和出風(fēng)溫度分別控制在170℃～190℃和90℃～110℃。?

本發(fā)明提供的ACE?C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽的制備方法，還可以?具有這樣的特征：酶膜反應(yīng)的反應(yīng)時間為3-4小時。?