[發明專利]豬鏈球菌分支酸合酶基因缺失株、其構建方法及應用

在審

• 申請號: 201410612576.3
• 申請日: 2015-08-04
• 公開（公告）號: CN104498417A
• 公開（公告）日: 2015-07-29
• 發明（設計）人: 蔡雪輝;王淑杰;劉永剛;金家民
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12Q1/14;C12R1/46
• 代理公司: 哈爾濱龍科專利代理有限公司 23206
• 代理人: 高媛

技術領域

本發明屬于細菌基因工程技術領域，涉及一種含氯霉素抗性標記的豬鏈球菌血清7型分支酸合酶基因缺失株、其構建方法及應用。

背景技術

豬鏈球菌(S.suis)屬厚壁菌門、芽孢桿菌綱、乳桿菌目中的鏈球菌科、鏈球菌屬；該菌呈球狀、多數成短鏈或成對排列，不形成芽孢，能形成莢膜。S.suis屬于革蘭氏陽性兼性厭氧球菌，根據其莢膜多糖抗原特性差異可將其分為35種血清型(1-34型，1/2型)。在養豬產業，S.suis感染是世界范圍的問題，它能引起豬腦膜炎、關節炎、肺炎、心內膜炎、流產以及仔豬的突然死亡。該病給養豬業造成的危害較大，是危害西方發達國家養豬業的三大細菌傳染病之一，也是多年來一直困擾中國養豬業發展的主要傳染病之一。同時，S.suis還是一個被忽視的新發人類病原體，能導致人類腦膜炎、心內膜炎、肺炎、關節炎、敗血癥及突然死亡的人獸共患病原體。在越南S.suis是導致成人腦膜炎的主要原因，其次是在泰國和香港。2005年，中國有一次重要的暴發，有200多人感染，死亡率達20％；病人表現為中毒性休克綜合癥，癥狀為高燒、全身乏力、惡心、嘔吐；在嚴重病例里還出現皮下出血及昏迷等癥狀。

目前國內外對豬鏈球菌毒力因子的研究都有所拓展，不僅包括對傳統毒素的研究，還包括對細胞壁蛋白(表面蛋白)的探索。有幾類毒力因子已被確認與豬鏈球菌的致病性有關：(1)莢膜多糖：它能保護豬鏈球菌在非免疫動物體內不被免疫系統的各種吞噬細胞吞噬。(2)溶血素：可能在豬鏈球菌侵入和裂解細胞的過程中發揮著重要作用。(3)黏附素：Haataja等證實39ku黏附素以半乳糖為受體的豬鏈球菌能通過一個糖脂結合位點黏附于豬咽部上皮組織。(4)谷氨酸脫氫酶：是新發現的一個與豬鏈球菌毒力相關的潛在毒力因子。(5)纖連蛋白結合蛋白：介導細胞與細胞外基質的相互作用，在細胞黏附、遷移、生長、分化和活化過程中起重要作用。除上述毒力因子外，國內外近年來還發現了一些新的毒力因子，如De?GreeffA研究發現了豬鏈球菌的第一個反應調節因子RevS，并認為其與豬鏈球菌的定居能力相關。44kb蛋白為豬鏈球菌2型的胞壁蛋白，?免疫斑點實驗證明它具有很強的免疫原性，高致病株的基因缺失株喪失了對豬的致病能力。屬于熱休克蛋白家族的IgG結合蛋白，還有一些其它可能與毒力相關的物質，如細菌表面物質纖毛、粘著素等。但由于毒力因子的多樣性以及復雜性，分離和鑒定更多的毒力因子已成為該領域研究的熱點。

隨著對S.suis研究的深入，對S.suis毒力因子的研究已成為熱點。基因組學和蛋白質組學提供了發現新毒力因子的手段，基因功能研究最經典和最有效的手段，是對目的基因進行缺失突變分析。分支酸合酶是莽草酸代謝途徑里的第7個酶，能催化5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸分支酸轉化成分支酸。申請人前期研究工作發現，在不同毒力的7型豬鏈球菌的比較蛋白組學中其表達量差異顯著，這個酶表達量的大小是否與豬鏈球菌的毒力強弱有關成為研究的焦點。

鑒于上述背景，采用RecA同源重組系統，利用溫敏自殺質粒pSET4s作為敲除的載體構建我國流行的S.suis?7型菌株的分支酸合酶基因缺失株，研究其遺傳特性、生長特性、對細胞的粘附力和侵襲性、對動物的致病力等生物學特性，為S.suis的防治及揭示S.suis的致病機理奠定基礎。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種含氯霉素抗性標記的豬鏈球菌血清7型分支酸合酶基因缺失株，該缺失株是將豬鏈球菌菌株分支酸合酶編碼的基因進行敲除，同時在缺失位置標記了氯霉素抗性基因而得到的菌株。

本發明的豬鏈球菌分支酸合酶基因缺失株為含氯霉素抗性標記的CMS基因缺失株SSΔCMS，其分類命名為豬鏈球菌Streptococcus?suis，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國微生物研究所，保藏編號為CGMCC?No.9735，保藏日期為2014年9月25日。

本發明的含氯霉素抗性標記的豬鏈球菌血清7型分支酸合酶基因缺失株，衍生于本試驗室研究人員從發病豬的腦組織里分離到的S.suis血清7型WC-ss7株(保藏號為CGMCC?No.3343，將其基因組上的分支酸合酶基因缺失，使CMS蛋白不表達，同時在缺失位置標記了氯霉素抗性基因，獲得了含有氯霉素抗性標記的CMS基因缺失突變株。