[發明專利]豬鏈球菌分支酸合酶基因缺失株、其構建方法及應用

在審

• 申請號: 201410612576.3
• 申請日: 2015-08-04
• 公開（公告）號: CN104498417A
• 公開（公告）日: 2015-07-29
• 發明（設計）人: 蔡雪輝;王淑杰;劉永剛;金家民
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12Q1/14;C12R1/46
• 代理公司: 哈爾濱龍科專利代理有限公司 23206
• 代理人: 高媛

1.一種豬鏈球菌分支酸合酶基因缺失株，其特征在于所述基因缺失株為含氯霉素抗性標記的CMS基因缺失株SS△CMS，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.9735。

2.一種權利要求1所述的豬鏈球菌分支酸合酶基因缺失株的構建方法，其特征在于所述構建方法步驟如下：

(1)以S.suis血清7型WC-ss7株基因組為模板，以CMSKOP1/2為引物擴增上游同源臂，以CMSKOP5/6為引物擴增下游同源臂，以pSET1載體為模板，CM-F/R為引物擴增氯霉素抗性盒；切膠回收3個片段，并以3段為模板，以CMSKOP1/6為引物，通過重疊PCR方法擴增上下游同源臂中間嵌氯霉素抗性盒的融合片段；純化該融合產物，克隆至pBLUE載體，轉化E.coli?DH5α感受態細胞，經過PCR和酶切鑒定后測序；將測序正確的質粒酶切回收目的片段，連接pSET4s載體，轉化E.coli?DH5α感受態細胞，再經PCR和酶切鑒定，最終獲得敲除載體；

(2)取5μL基因敲除載體電轉化50μL?WC-ss7感受態細胞，經30℃、CO₂孵箱內培養48h，Cm^R的THB平板上長出抗性克隆，挑選正確的克隆先后經過30℃雙交換和40℃質粒丟失，最后通過點板的方法獲得其因敲除突變體；提取突變株基因組作模板，分別用不同引物進行PCR鑒定，將鑒定正確的定義為SS△CMS。

3.根據權利要求2所述的豬鏈球菌分支酸合酶基因缺失株的構建方法，其特征在于所述CMS蛋白編碼基因的序列如SEQNO.1所示。

4.根據權利要求2所述的豬鏈球菌分支酸合酶基因缺失株的構建方法，其特征在于所述擴增上游同源臂序列的引物序列如下所示：

CMSKOP1：ATTGTCGACGCGGTCACTTGGATTTGG；

CMSKOP2：CCTCGGAACCCATCGAATTATCCATGAGACTCACCAGC。

5.根據權利要求2所述的豬鏈球菌分支酸合酶基因缺失株的構建方法，其特征在于所述擴增下游同源臂序列的引物序列如下所示：

CMSKOP3：GCGGGATCCAATGAAGAGTTAAAACGGCG；

CMSKOP4：GTGGTCGACAATAGTATCTCCATCTCGCT。

6.根據權利要求2所述的豬鏈球菌分支酸合酶基因缺失株的構建方法，其特征在于所述擴增氯霉素抗性基因的引物序列如下所示：

CM-F：TAATTCGATGGGTTCCGAGGCTCAA；

CM-R：CACCGAACTAGAGCTTGATGAAAAT。

7.一種權利要求1所述的豬鏈球菌分支酸合酶基因缺失株在試驗中作為標準的豬鏈球菌7型強毒菌株的應用。