[發(fā)明專利]一種從病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410608665.0
• 申請日: 2014-10-31
• 公開（公告）號: CN104327177A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韓兵;王爍;萬君花
• 申請（專利權(quán)）人: 王爍
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C07K1/16
• 代理公司: 北京輕創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11212
• 代理人: 楊立

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種從病人痰液中提取具有抗病原原發(fā)性免疫生物活性小分子肽α防御素的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

防御素是廣泛存在于包括植物、無脊椎動物和脊椎動物在內(nèi)的多種生物體的一種抗微生物肽。人類嗜中性粒細胞肽(HNP)是人類最主要的抗微生物多肽，主要表達在中性粒細胞(PMN)中，占細胞總蛋白的5％，細胞內(nèi)嗜天青顆粒蛋白50％以上。HNP是一種活性肽，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌具有廣譜的抗菌作用，還具有抗病毒以及抗某些特異性的細胞毒性物質(zhì)的作用。人體內(nèi)已知的α-防御素有6種，分別為人類中性粒細胞防御素1-4和人類防御素5-6。人類中性粒細胞防御素1主要存在與中性粒細胞中，在單核細胞、自然殺傷細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞和幼樹突狀細胞中也有分布。健康情況下，含量極低，一旦機體發(fā)生病原體感染后，體內(nèi)濃度就會迅速升高，發(fā)揮抗病原微生物的作用。人類中性粒細胞α防御素1通過形成電荷依賴性膜通道，改變病原體膜的通透性，導(dǎo)致其胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，胞體崩解，從而引起病原體死亡。另外，人類中性粒細胞防御素1還能中和病菌釋放的致死毒素，保護機體細胞免于因為細菌毒素而引起的細胞凋亡。

人類中性粒細胞α防御素1發(fā)揮抗病毒作用則是通過與靶向作用于病毒包膜、糖蛋白等、抑制病毒與細胞膜的融合、對入侵病毒毒力的中和以及干擾病毒復(fù)制等多種機制實現(xiàn)的。人中性粒細胞防御素1能通過作用于靶細胞激活蛋白激酶C信號通路使病毒失活而抑制HIV病毒的復(fù)制，最終發(fā)揮抗艾滋病的作用(Chang?TL,et?al.J?Clin?Invest,2005,115:765-773)。對于甲型流感病毒(Doss?M,et?al.J?Immunol,2009,192:7878-7887)、單純皰疹病毒(Hazrati?E,et?al.J?Immunol,2006,177:8658-8666)等病原體，人中性粒細胞防御素1也證明有效。與任何其他抗生素不同的是，HNP采取完全不同的殺菌機制，直擊微生物壁，并導(dǎo)致微生物裂解。因此，HNP代表一類新的抗生素，其獨特的殺菌機制，導(dǎo)致目標微生物無法產(chǎn)生耐藥性。

熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，防御素抗癌新藥對病原體和癌細胞S期過程具有阻抑作用，這種阻抑作用對癌細胞和正常細胞有選擇性，并且可誘導(dǎo)DNA單鏈斷裂，即這種阻抑作用只選擇性地殺死癌細胞，而對正常細胞沒有阻抑殺傷作用。研究成果表明，防御素抗癌新藥療效顯著，生物技術(shù)制備工藝穩(wěn)定，具有較高的開發(fā)價值。

目前市場上的α防御素主要依賴于化學(xué)合成或細菌表達重組蛋白，雖然具有天然多肽的氨基酸序列，但由于缺乏適當?shù)募毎麅?nèi)表達翻譯后的蛋白折疊與修飾，所以其活性均不及天然蛋白，而且生產(chǎn)成本高，產(chǎn)量低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種新穎簡便的從病人痰液中直接提取純化天然小分子α防御素多肽的提取方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足。

由于本方法是直接從廢棄的病人痰液標本中提取天然中性粒細胞α防御素，并通過優(yōu)化痰液勻漿制備及乙酸提取條件，建立監(jiān)控洗脫曲線從而獲得最佳提取方案。其方法簡便直接、成本低廉、產(chǎn)量高，終產(chǎn)物為生物活性極高的天然蛋白。

鑒于其極高的生物活性與純度，本發(fā)明的另一目的是為α防御素的抗體制備、檢測試劑盒開發(fā)以及科學(xué)研究提供優(yōu)質(zhì)的免疫原，標準品與高效試劑。

本發(fā)明的最終目的是利用本方法提取出可開發(fā)為具有臨床抗微生物效價的α防御素多肽。

本發(fā)明提供的一種從病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，包括以下步驟：

(1)收集病人的痰液，并用低溫或超低溫保存，直至提取應(yīng)用；

(2)向步驟(1)得到的痰液中加乙酸勻漿，4℃過夜攪拌浸提，離心，棄沉淀，取上清，制備粗提物；

(3)向步驟(2)中得到的粗提物中加入DTT，混勻；

(4)將步驟(3)得到的混合物上樣于Pullulan?P-10凝膠柱，用乙酸洗脫，用自動收集器直接收集洗脫液到各收集管內(nèi)，每管10mL；經(jīng)蛋白質(zhì)檢測儀監(jiān)測在波長620nm的吸光度，并制作出洗脫曲線；根據(jù)洗脫曲線，選取從開始點和第一個高峰點的洗脫液樣本進行蛋白分子質(zhì)譜分析定性；

(5)將步驟(4)收集到的洗脫液超濾濃縮，得到小分子多肽，真空凍干保存；

(6)用步驟(5)得到的小分子多肽做蛋白氨基酸測序，并通過瓊脂糖彌散方法檢測其對大腸桿菌的抗菌活性。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進。