[發明專利]一種從病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法

在審

• 申請號: 201410608665.0
• 申請日: 2014-10-31
• 公開（公告）號: CN104327177A
• 公開（公告）日: 2015-02-04
• 發明（設計）人: 韓兵;王爍;萬君花
• 申請（專利權）人: 王爍
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C07K1/16
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 楊立

1.一種從病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)收集病人的痰液，并保存在冰水混合物狀態；

(2)向步驟(1)得到的痰液中加乙酸勻漿，4℃過夜攪拌浸提，離心，棄沉淀，取上清，制備粗提物；

(3)向步驟(2)中得到的粗提物中加入DTT，混勻；

(4)將步驟(3)得到的混合物上樣于Pullulan?P-10凝膠柱，用乙酸洗脫，用自動收集器直接收集洗脫液到各收集管內，每管10mL；經蛋白質檢測儀監測在波長620nm的吸光度，并制作出洗脫曲線；根據洗脫曲線，從開始點和第一個高峰點收集到的洗脫液中取樣進行蛋白分子質譜分析定性；

(5)將步驟(4)收集的洗脫液超濾濃縮，得到小分子多肽，真空凍干保存；

(6)用步驟(5)得到的小分子多肽做蛋白氨基酸測序，并用瓊脂糖彌散法檢測其對大腸桿菌的抗菌活性。

2.根據權利要求1所述一種從病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，其特征在于，步驟(1)中，收集病人痰液過程中，一直用干冰保持痰液在冰水混合物狀態，并在-80℃下保存至純化提取。

3.根據權利要求1所述一種從病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，其特征在于，步驟(2)的具體步驟為：向步驟(1)得到的痰液中按體積比為1:1的比例加入體積分數為10％的乙酸冰水混合物，用勻漿器制備痰液勻漿，攪拌混勻，并于4℃冰箱內旋轉過夜，然后在4℃下，14000rpm離心30min，去沉淀，留上清為粗提物。

4.根據權利要求1所述一種從病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，其特征在于，步驟(3)中，向步驟(2)得到的粗提物中按1:10的體積比加入0.2mM?DTT，混勻。

5.根據權利要求1所述一種從病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，其特征在于，步驟(4)中，將步驟(3)得到的混合物上樣于Pullulan?P-10凝膠柱，用乙酸沖洗凝膠柱，所述Pullulan?P-10凝膠柱的尺寸為2.5cm×120cm。

6.根據權利要求1所述一種從病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，其特征在于，步驟(4)中，用于洗脫的乙酸體積分數為5％，洗脫過程于室溫下，利用重力自然完成。

7.根據權利要求1所述一種從病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，其特征在于，步驟(4)中，選取洗脫液樣本，經質譜分析確定其分子量為3442.57kD，等同于α防御素多肽的分子量。

8.根據權利要求1所述一種從病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，其特征在于，步驟(6)中，用步驟(5)中超濾濃縮后得到的小分子多肽經瓊脂糖彌散法檢測，測得其對大腸桿菌具有抗菌活性。

9.根據權利要求1至8任一項所述一種從病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，其特征在于，步驟(6)中，所述蛋白氨基酸測序的具體步驟為：將步驟(5)得到的有抑菌作用的洗脫液進行Tricine-PAGE純化，蛋白條帶轉印至PVDF膜，采用sanger水解逐段分析法做氨基酸分析；若得出氨基酸序列為Ala-Cys-Tyr-Cys-Arg-Ile-Pro-Ala-Cys-Ile-Ala-Gly-Glu-Arg-Arg-Tyr-Gly-Thr-Cys-Ile-Tyr-Gln-Gly-Arg-Leu-Trp-Ala-Phe-Cys-Cys，則證明提取出的小分子多肽即為α防御素。

10.根據權利要求9所述一種從病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，其特征在于，所述Tricine-PAGE純化的濃縮膠為5％T、3％C、80V、20min，分離膠為15％T、6％C、100V、2h，并將大于3kD小于5kD的蛋白條帶轉印至PVDF膜。