[發(fā)明專利]基于CRISPR/Cas9技術(shù)的條件性基因敲除方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410608382.6
• 申請日: 2014-11-03
• 公開（公告）號: CN104404036B
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄭敦武;營婷;姜莎莎;俞曉峰;歐陽應(yīng)斌;徐文靜;黎妃鳳;朱道云;王正龍
• 申請（專利權(quán)）人: 賽業(yè)（蘇州）生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/85
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙)32204
• 代理人: 柏尚春

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因修飾技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于CRISPR/Cas9技術(shù)的條件性基因敲除方法。

背景技術(shù)

隨著科技的進(jìn)步和對生命科學(xué)領(lǐng)域的不斷探索，人們對活體內(nèi)某一基因在特定組織、細(xì)胞及時間內(nèi)的表達(dá)情況的研究顯得更為迫切。近年來迅速發(fā)展的位點特異性重組技術(shù)是適應(yīng)這種需要而產(chǎn)生的關(guān)鍵基因操作工具，其能夠在一定發(fā)育階段或在特定的組織中誘導(dǎo)靶基因失活，避免了靶基因缺失引起的胚胎早期死亡或出現(xiàn)復(fù)雜表型，刪除篩選標(biāo)記基因，從而對目的基因做出完整的功能分析。目前被廣泛應(yīng)用的重組酶系統(tǒng)有Cre-LoxP系統(tǒng)、FLP-FRT系統(tǒng)、R-RS系統(tǒng)以及I-SceI系統(tǒng)，但應(yīng)用最多的還是Cre-LoxP系統(tǒng)。

Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)是條件性基因打靶、誘導(dǎo)性基因打靶、時空特異性基因打靶策略的核心技術(shù)。

Cre-LoxP系統(tǒng)來源于P1噬菌體，包含以下兩種成分：

①一段34bp的DNA序列，含有兩個13bp的反向重復(fù)序列和一個8bp的核心序列。這段34bp序列是重組酶的識別位點，被稱為LoxP位點。

②Cre重組酶，它是一種由343個氨基酸組成的單體蛋白，可以引發(fā)LoxP位點的DNA重組。任何序列的DNA，當(dāng)其位于兩個LoxP位點之間的時候，在Cre重組酶的作用下要么被缺失(兩個LoxP位點的方向相同)，要么方向發(fā)生倒轉(zhuǎn)(兩個LoxP位點的方向相反)，如圖1所示。

利用Cre-LoxP系統(tǒng)實現(xiàn)體內(nèi)某特定基因在特定條件下的敲除，需要兩只轉(zhuǎn)基因小鼠。第一只小鼠：首先在體外構(gòu)建一個目的基因，其兩端分別含有一個LoxP位點，之后將構(gòu)建好的這段基因序列轉(zhuǎn)入胚胎干細(xì)胞內(nèi)。經(jīng)過處理的胚胎干細(xì)胞被植入到假孕小鼠的子宮內(nèi)，使其重新發(fā)育成為一個完整的胚胎，最終成為一只轉(zhuǎn)基因小鼠。在這只轉(zhuǎn)基因小鼠中，LoxP位點被引入到相應(yīng)基因的內(nèi)含子內(nèi)，理論上不會對相應(yīng)基因的功能產(chǎn)生影響，因此一般情況下，該小鼠的表型是正常的。第二只轉(zhuǎn)基因小鼠：一般采用卵母細(xì)胞注射或者胚胎干細(xì)胞技術(shù)獲得，在這只小鼠中，Cre重組酶被置于某特定基因啟動子的調(diào)控之下，可以使其在某特定的條件下表達(dá)。最后，讓這兩只小鼠交配，產(chǎn)生的同時含有上述兩種基因型的子代小鼠就會在某一特定類型的細(xì)胞中缺失某一特定的基因。

人工核酸內(nèi)切酶Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPRs/Cas9系統(tǒng)，廣泛存在于原核生物(大多數(shù)的細(xì)菌和所有的古細(xì)菌)基因組中。CRISPRs/Cas9系統(tǒng)自2002年首次被定義以來，一直以其獨特的結(jié)構(gòu)與特殊的功能引起各國科學(xué)家的共同關(guān)注。CRISPR大致分為3類，用于基因修飾的是II型CRISPR系統(tǒng)，其成分較為簡單，只需要Cas9和兩個非編碼的RNA：crRNA與反式激活crRNA(tracrRNA)，三個組分即可介導(dǎo)外源DNA片段的靶向降解。在實際的操作過程中，我們只需要設(shè)計特異性的sgRNA，并與Cas9蛋白一起轉(zhuǎn)入到小鼠的受精卵中即可。

Cre-loxp重組酶系統(tǒng)雖然能夠介導(dǎo)基因的條件性敲除，避免缺失功能基因造成的胚胎過早死亡等傳統(tǒng)基因打靶技術(shù)的劣勢，但還是存在很多不確定性：

①哺乳動物基因組中存在隱含的/假的LoxP序列，其序列和LoxP的保守序列可能并不完全相同，但能夠被Cre重組酶識別而發(fā)生重組，進(jìn)而引起不必要的DNA損傷。

②特異性差，很難得到存在雙轉(zhuǎn)基因的后代小鼠，成功率<50％。

③鑒定篩選過程復(fù)雜、耗時長。

現(xiàn)有的CRISPR/Cas9系統(tǒng)雖然操作簡單，靶向精確性高，但不能實現(xiàn)組織、細(xì)胞、時空的特異性敲除。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是提供了一種用于基因敲除的引物。

本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是提供了上述的引物在基因敲除方面的應(yīng)用。

本發(fā)明所要解決的第三個技術(shù)問題是提供了一種基于CRISPR/Cas9技術(shù)的條件性基因敲除方法。