[發明專利]基于CRISPR/Cas9技術的條件性基因敲除方法

有效

• 申請號: 201410608382.6
• 申請日: 2014-11-03
• 公開（公告）號: CN104404036B
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發明（設計）人: 鄭敦武;營婷;姜莎莎;俞曉峰;歐陽應斌;徐文靜;黎妃鳳;朱道云;王正龍
• 申請（專利權）人: 賽業（蘇州）生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/85
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙)32204
• 代理人: 柏尚春

技術領域

本發明屬于基因修飾技術領域，具體涉及基于CRISPR/Cas9技術的條件性基因敲除方法。

背景技術

隨著科技的進步和對生命科學領域的不斷探索，人們對活體內某一基因在特定組織、細胞及時間內的表達情況的研究顯得更為迫切。近年來迅速發展的位點特異性重組技術是適應這種需要而產生的關鍵基因操作工具，其能夠在一定發育階段或在特定的組織中誘導靶基因失活，避免了靶基因缺失引起的胚胎早期死亡或出現復雜表型，刪除篩選標記基因，從而對目的基因做出完整的功能分析。目前被廣泛應用的重組酶系統有Cre-LoxP系統、FLP-FRT系統、R-RS系統以及I-SceI系統，但應用最多的還是Cre-LoxP系統。

Cre-LoxP重組酶系統是條件性基因打靶、誘導性基因打靶、時空特異性基因打靶策略的核心技術。

Cre-LoxP系統來源于P1噬菌體，包含以下兩種成分：

①一段34bp的DNA序列，含有兩個13bp的反向重復序列和一個8bp的核心序列。這段34bp序列是重組酶的識別位點，被稱為LoxP位點。

②Cre重組酶，它是一種由343個氨基酸組成的單體蛋白，可以引發LoxP位點的DNA重組。任何序列的DNA，當其位于兩個LoxP位點之間的時候，在Cre重組酶的作用下要么被缺失(兩個LoxP位點的方向相同)，要么方向發生倒轉(兩個LoxP位點的方向相反)，如圖1所示。

利用Cre-LoxP系統實現體內某特定基因在特定條件下的敲除，需要兩只轉基因小鼠。第一只小鼠：首先在體外構建一個目的基因，其兩端分別含有一個LoxP位點，之后將構建好的這段基因序列轉入胚胎干細胞內。經過處理的胚胎干細胞被植入到假孕小鼠的子宮內，使其重新發育成為一個完整的胚胎，最終成為一只轉基因小鼠。在這只轉基因小鼠中，LoxP位點被引入到相應基因的內含子內，理論上不會對相應基因的功能產生影響，因此一般情況下，該小鼠的表型是正常的。第二只轉基因小鼠：一般采用卵母細胞注射或者胚胎干細胞技術獲得，在這只小鼠中，Cre重組酶被置于某特定基因啟動子的調控之下，可以使其在某特定的條件下表達。最后，讓這兩只小鼠交配，產生的同時含有上述兩種基因型的子代小鼠就會在某一特定類型的細胞中缺失某一特定的基因。

人工核酸內切酶Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPRs/Cas9系統，廣泛存在于原核生物(大多數的細菌和所有的古細菌)基因組中。CRISPRs/Cas9系統自2002年首次被定義以來，一直以其獨特的結構與特殊的功能引起各國科學家的共同關注。CRISPR大致分為3類，用于基因修飾的是II型CRISPR系統，其成分較為簡單，只需要Cas9和兩個非編碼的RNA：crRNA與反式激活crRNA(tracrRNA)，三個組分即可介導外源DNA片段的靶向降解。在實際的操作過程中，我們只需要設計特異性的sgRNA，并與Cas9蛋白一起轉入到小鼠的受精卵中即可。

Cre-loxp重組酶系統雖然能夠介導基因的條件性敲除，避免缺失功能基因造成的胚胎過早死亡等傳統基因打靶技術的劣勢，但還是存在很多不確定性：

①哺乳動物基因組中存在隱含的/假的LoxP序列，其序列和LoxP的保守序列可能并不完全相同，但能夠被Cre重組酶識別而發生重組，進而引起不必要的DNA損傷。

②特異性差，很難得到存在雙轉基因的后代小鼠，成功率<50％。

③鑒定篩選過程復雜、耗時長。

現有的CRISPR/Cas9系統雖然操作簡單，靶向精確性高，但不能實現組織、細胞、時空的特異性敲除。

發明內容

發明目的：本發明所要解決的第一個技術問題是提供了一種用于基因敲除的引物。

本發明所要解決的第二個技術問題是提供了上述的引物在基因敲除方面的應用。

本發明所要解決的第三個技術問題是提供了一種基于CRISPR/Cas9技術的條件性基因敲除方法。