[發明專利]基于CRISPR/Cas9技術的條件性基因敲除方法

有效

• 申請號: 201410608382.6
• 申請日: 2014-11-03
• 公開（公告）號: CN104404036B
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發明（設計）人: 鄭敦武;營婷;姜莎莎;俞曉峰;歐陽應斌;徐文靜;黎妃鳳;朱道云;王正龍
• 申請（專利權）人: 賽業（蘇州）生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/85
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙)32204
• 代理人: 柏尚春

1.一種基于CRISPR/Cas9技術的條件性基因敲除方法，其特征在于，包括以下步驟：

表達載體的構建：構建組織特異性表達的sgRNA載體和組成型/藥物誘導型表達的Cas9載體；

表達載體測序正確后，分別電轉到ES細胞中；通過PCR或Southern Blot驗證，分別獲得含有sgRNA表達質粒的ES細胞和含有Cas9蛋白的ES細胞并擴大培養；

將含有Cre重組酶的質粒轉化到含有Cas9蛋白的ES細胞中，獲得沒有篩選標記的Cas9表達載體的ES細胞；

將含有Cas9表達載體的ES細胞與含有sgRNA表達質粒的ES細胞分別注射到囊胚中；

將囊胚分別移植到代孕母鼠中，進行飼養；生產出的后代即為F₀代組織特異性表達的sgRNA 小鼠和組成型/藥物誘導型的Cas9工具鼠；

將檢測正確的Cas9工具鼠與sgRNA小鼠雜交，獲得組織特異性/藥物誘導型基因敲除小鼠；

該sgRNA載體依次是由組織特異性啟動子、Cre重組酶、二個反向的LoxP位點、夾在二個反向的LoxP位點之間的U6啟動子、20nt目標區域、sgRNA框架以及U6終止區域組成。

2.根據權利要求1所述的基因敲除方法，其特征在于，所述F₀代組織特異性表達sgRNA 小鼠的構建方法如下：

21）sgRNA片段設計與合成：

22）將步驟21）合成的sgRNA片段退火為雙鏈片段；

23）將雙鏈片段連接到線性化載體Church Cloning Vector或pCR-Blunt II-TOPO中得到連接產物sgRNA表達質粒；

24）將連接產物sgRNA表達質粒轉化、挑選陽性克隆，進行菌落PCR驗證；

25）將菌落PCR得到的產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測；

26）將驗證正確的克隆進行測序得到測序正確的sgRNA表達質粒；

27）將測序正確的sgRNA表達質粒電轉至小鼠的ES細胞中；經Southern Blot驗證得到驗證正確的ES細胞；

28）將驗證正確的ES細胞注射到小鼠的囊胚中，隨后轉移至代孕母鼠中，最后得到F₀代sgRNA的小鼠。

3.根據權利要求1所述的基因敲除方法，其特征在于，所述組成型/藥物誘導型的Cas9工具鼠的構建方法如下：

31）Cas9蛋白的擴增；

32）Cas9蛋白與Rosa26載體連接得到組成型/藥物誘導型表達的Cas9載體；

33）將測序正確的組成型/藥物誘導型表達的Cas9載體線性化后電轉到ES細胞中得到含有Cas9蛋白的ES細胞；

34）用含有新霉素的培養基篩選含有Cas9蛋白的ES細胞得到含有Cas9蛋白的陽性ES細胞；隨后用Southern Blot驗證；

35）將帶有Cre重組酶的質粒轉到含有Cas9蛋白陽性ES細胞中，獲得沒有篩選標記的陽性ES細胞；

36）將沒有篩選標記的陽性ES細胞顯微注射到小鼠囊胚中，而后轉移至代孕母鼠中，最后得到含有Cas9蛋白的工具鼠。

4.根據權利要求2所述的基因敲除方法，其特征在于，所述菌落PCR采用的引物序列如SEQ NO:3和 SEQ NO:4所示，菌落PCR的擴增條件為：預變性94℃，3min；變性94℃，20s；退火58℃，25s；延伸72℃，20s，25個循環，終延伸72℃，5min。

5.根據權利要求3所述的基因敲除方法，其特征在于，所述Cas9蛋白的擴增步驟如下：設計擴增Cas9蛋白的引物，其序列如SEQ NO:5和 SEQ NO:6所示；采用PCR擴增Cas9蛋白全序列，PCR擴增條件為：預變性98℃，3min；變性98℃，25s；退火63℃，25s；延伸72℃，4min30s，25個循環，終延伸72℃，5min。

6.根據權利要求3所述的基因敲除方法，其特征在于，所述Cas9蛋白與Rosa26載體連接步驟如下：用Clontech公司的In-Fusion^? HD Clinging Kit試劑盒將檢測正確的Cas9序列與經AsisI與HpaI酶線性化的載體連接，將連接好的載體轉化大腸桿菌、挑取克隆子、菌落PCR驗證后，送蘇州金唯智公司測序，其中菌落PCR引物采用的是SEQ NO:7和 SEQ NO:8所示的引物，該菌落PCR的擴增條件為：預變性95℃，3min；變性95℃，30s；退火58℃，30s；延伸72℃，45s，26個循環，終延伸72℃，5min。