[發(fā)明專利]一種誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化內(nèi)耳毛細(xì)胞的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410607061.4
• 申請(qǐng)日: 2014-10-31
• 公開（公告）號(hào): CN104403988B
• 公開（公告）日: 2017-09-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 項(xiàng)黎新;潘若浪;邵建忠;王萍;劉小園
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司33201
• 代理人: 黃美娟,李世玉

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種內(nèi)耳毛細(xì)胞的分化方法，特別涉及一種誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化獲得內(nèi)耳毛細(xì)胞的方法。

(二)背景技術(shù)

聽力損失是嚴(yán)重影響人類生活質(zhì)量的世界性頑疾之一，目前尚無根治方法。哺乳動(dòng)物內(nèi)耳毛細(xì)胞的不可修復(fù)損傷被認(rèn)為是導(dǎo)致聽力損失的最主要原因之一。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，人類內(nèi)耳聽覺毛細(xì)胞為特化終末細(xì)胞，不再具有再生修復(fù)能力，其損傷是不可逆的。近年來研究發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物胚胎期或早期毛細(xì)胞有可能再生，并且通過轉(zhuǎn)染促毛細(xì)胞分化發(fā)育相關(guān)基因在成年耳蝸中發(fā)現(xiàn)不成熟毛細(xì)胞的異位發(fā)生，提示了哺乳動(dòng)物毛細(xì)胞在一定誘導(dǎo)條件下實(shí)現(xiàn)再生的可能性，但對(duì)于病變過程中毛細(xì)胞的修復(fù)再生仍存在很大挑戰(zhàn)。因此尋找毛細(xì)胞再生的前體細(xì)胞來源，以便開發(fā)毛細(xì)胞損傷修復(fù)干預(yù)策略是聽力損失治療的當(dāng)務(wù)之急。

干細(xì)胞以其全能或多能性以及高度的自我增殖能力等諸多優(yōu)點(diǎn)而成為組織工程和細(xì)胞治療領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。近年來越來越多研究展示了胚胎干細(xì)胞和各種來源的成體干細(xì)胞在組織損傷修復(fù)和疾病治療研究中的極大優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用潛能，以干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為基礎(chǔ)，利用干細(xì)胞相關(guān)技術(shù)，探討聽覺系統(tǒng)損傷修復(fù)特別是毛細(xì)胞的損傷和再生已成為可能。同時(shí)，由于毛細(xì)胞數(shù)量稀少，對(duì)于毛細(xì)胞發(fā)育的分子機(jī)制研究仍然非常有限。因此，探索建立有效的干細(xì)胞分化毛細(xì)胞誘導(dǎo)體系，不僅能為毛細(xì)胞再生治療提供有效細(xì)胞來源，而且將為探討毛細(xì)胞分化發(fā)育相關(guān)分子和信號(hào)機(jī)制提供研究模型。胚胎干細(xì)胞具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和分化全能性等優(yōu)點(diǎn)，是干細(xì)胞分化領(lǐng)域的重點(diǎn)。本發(fā)明利用胚胎干細(xì)胞，建立了一種條件培養(yǎng)液、細(xì)胞因子和滋養(yǎng)層細(xì)胞相結(jié)合有效誘導(dǎo)分化內(nèi)耳毛細(xì)胞的方法。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化獲得內(nèi)耳毛細(xì)胞的方法，本發(fā)明方法首先用條件培養(yǎng)液和誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化毛細(xì)胞前體細(xì)胞；然后利用誘導(dǎo)培養(yǎng)液與滋養(yǎng)層細(xì)胞(即雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞)結(jié)合的方法誘導(dǎo)前體細(xì)胞分化成熟內(nèi)耳毛細(xì)胞，通過本方法誘導(dǎo)，能夠得到高比例的毛細(xì)胞前體細(xì)胞和成熟內(nèi)耳毛細(xì)胞。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化內(nèi)耳毛細(xì)胞的方法，所述的方法為：(1)將小鼠胚胎干細(xì)胞接種至條件培養(yǎng)液，在37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)4-5天，形成細(xì)胞團(tuán)；取細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)液Ⅰ中，在37℃、5％CO₂條件誘導(dǎo)培養(yǎng)12-14天，獲得胚胎干細(xì)胞分化的毛細(xì)胞前體細(xì)胞；所述條件培養(yǎng)液終濃度組成為：體積濃度30-50％HepG2條件培養(yǎng)液、1mM非必需氨基酸、5μMβ-巰基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、體積濃度10％FBS(胎牛血清)，溶劑為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液；所述HepG2條件培養(yǎng)液按如下方法制備：將HepG2細(xì)胞以5×10⁴cells/cm²密度接種于培養(yǎng)皿中，按1.75×10⁵cells/mL培養(yǎng)液的量加入含體積終濃度10％FBS的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)4-5天后收集上層培養(yǎng)液，離心除去細(xì)胞碎片，獲得上層清液和下層沉淀，棄去下層沉淀，取上層清液經(jīng)抽濾(優(yōu)選0.22μm濾膜抽濾)，濾液即為HepG2條件培養(yǎng)液；所述誘導(dǎo)液Ⅰ終濃度組成為：體積濃度5％FBS、5-15ng/ml IGF-1(胰島素樣生長(zhǎng)因子-1)、20-30ng/ml EGF(表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子)、1×N2、1×B27、45-55ng/mL FGF3(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子3)、45-55ng/mL FGF10(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10)、45-55ng/mL肝素鈉，溶劑為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液；

(2)將雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞(優(yōu)選生長(zhǎng)至90％匯合度的雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞)用含終濃度2μg/ml絲裂霉素C的DMEM培養(yǎng)液浸泡，在37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時(shí)，棄去培養(yǎng)液，細(xì)胞用pH值為7.4的PBS緩沖液洗滌，即為預(yù)處理后的雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞；