[發(fā)明專利]一種誘導(dǎo)小鼠胚胎干細胞分化內(nèi)耳毛細胞的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410607061.4
• 申請日: 2014-10-31
• 公開（公告）號: CN104403988B
• 公開（公告）日: 2017-09-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 項黎新;潘若浪;邵建忠;王萍;劉小園
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司33201
• 代理人: 黃美娟,李世玉

1.一種誘導(dǎo)小鼠胚胎干細胞分化內(nèi)耳毛細胞的方法，其特征在于所述的方法為：(1)將小鼠胚胎干細胞接種至條件培養(yǎng)液，在37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)4-5天，形成細胞團；取細胞團轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)液Ⅰ中，在37℃、5％CO₂條件誘導(dǎo)培養(yǎng)12-14天，獲得胚胎干細胞分化的毛細胞前體細胞；所述條件培養(yǎng)液終濃度組成為：體積濃度30-50％HepG2條件培養(yǎng)液、1mM非必需氨基酸、5μMβ-巰基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、體積濃度10％FBS，溶劑為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液；所述HepG2條件培養(yǎng)液按如下方法制備：將HepG2細胞以5×10⁴cells/cm²密度接種于培養(yǎng)皿中，按1.75×10⁵cells/mL培養(yǎng)液的量加入含體積濃度10％FBS的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)4-5天后收集上層培養(yǎng)液，離心，取上層清液經(jīng)抽濾，濾液即為HepG2條件培養(yǎng)液；所述誘導(dǎo)液Ⅰ終濃度組成為：體積濃度5％FBS、5-15ng/ml IGF-1、20-30ng/ml EGF、1×N2、1×B27、45-55ng/mL FGF3、45-55ng/mL FGF10、45-55ng/mL肝素鈉，溶劑為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液；

(2)將雞胚橢圓囊間質(zhì)細胞用含終濃度2μg/ml絲裂霉素C的DMEM培養(yǎng)液浸泡，在37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時，棄去培養(yǎng)液，細胞用pH值為7.4的PBS緩沖液洗滌，即為預(yù)處理后的雞胚橢圓囊間質(zhì)細胞；

(3)將步驟(1)獲得的毛細胞前體細胞進行消化處理，靜置沉淀，棄沉淀，將細胞懸液接種至預(yù)處理后的雞胚橢圓囊間質(zhì)細胞上，加入誘導(dǎo)液Ⅱ，在37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)誘導(dǎo)3-4周，獲得分化成熟的內(nèi)耳毛細胞；所述誘導(dǎo)液Ⅱ終濃度組成：體積濃度5％FBS、20-30ng/ml EGF、1×N2、1×B27、5-15μM RA、5μM DAPT，溶劑為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液。

2.如權(quán)利要求1所述誘導(dǎo)小鼠胚胎干細胞分化內(nèi)耳毛細胞的方法，其特征在于所述條件培養(yǎng)液終濃度組成為：體積濃度40％HepG2條件培養(yǎng)液、1mM非必需氨基酸、5μMβ-巰基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、體積濃度10％FBS，溶劑為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液。

3.如權(quán)利要求1所述誘導(dǎo)小鼠胚胎干細胞分化內(nèi)耳毛細胞的方法，其特征在于所述誘導(dǎo)液Ⅰ終濃度組成為：體積濃度5％FBS、10ng/ml IGF-1、25ng/mlEGF、1×N2、1×B27、50ng/mL FGF3、50ng/mL FGF10、50ng/mL肝素鈉，溶劑為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液。

4.如權(quán)利要求1所述誘導(dǎo)小鼠胚胎干細胞分化內(nèi)耳毛細胞的方法，其特征在于所述雞胚橢圓囊間質(zhì)細胞按如下方法制備：從受精18天雞胚中分離橢圓囊，0.25％胰酶，37℃消化15-20分鐘后，用體積終濃度10％FBS+DMEM培養(yǎng)液中止，過200目篩網(wǎng)，收集細胞懸液，1000rpm/min離心6-8分鐘，細胞用體積終濃度10％FBS+DMEM培養(yǎng)液懸浮，接種于培養(yǎng)瓶中，置37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48小時后首次換液，棄去未貼壁細胞，貼壁繼續(xù)培養(yǎng)至90％匯合度，用0.25％胰酶/EDTA消化并接種至細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，記為P1代細胞，通過如此傳代培養(yǎng)，至P3代，即得到雞胚橢圓囊間質(zhì)細胞。

5.如權(quán)利要求1所述誘導(dǎo)小鼠胚胎干細胞分化內(nèi)耳毛細胞的方法，其特征在于所述毛細胞前體細胞用accutase進行消化處理。

6.如權(quán)利要求1所述誘導(dǎo)小鼠胚胎干細胞分化內(nèi)耳毛細胞的方法，其特征在于所述誘導(dǎo)液Ⅱ終濃度組成：體積濃度5％FBS、25ng/ml EGF、1×N2、1×B27、10μM RA、5μM DAPT，溶劑為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液。

7.如權(quán)利要求1所述誘導(dǎo)小鼠胚胎干細胞分化內(nèi)耳毛細胞的方法，其特征在于步驟(3)所述細胞懸液以10⁵個/cm²的密度接種至預(yù)處理后的雞胚橢圓囊間質(zhì)細胞上。

8.如權(quán)利要求1所述誘導(dǎo)小鼠胚胎干細胞分化內(nèi)耳毛細胞的方法，其特征在于所述的方法按如下步驟進行：(1)將小鼠胚胎干細胞ES-D3接種至含質(zhì)量濃度1％瓊脂的培養(yǎng)板上，加入條件培養(yǎng)液，在37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)4-5天，每天換液；取細胞團轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)孔板內(nèi)，加入誘導(dǎo)液Ⅰ，在37℃、5％CO₂條件誘導(dǎo)培養(yǎng)12-14天，每天換液，獲得胚胎干細胞分化的毛細胞前體細胞；所述條件培養(yǎng)液終濃度組成為：體積濃度40％HepG2條件培養(yǎng)液、1mM非必需氨基酸、5μMβ-巰基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、體積濃度10％FBS，溶劑為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液；所述HepG2條件培養(yǎng)液按如下方法制備：將HepG2細胞以5×10⁴cells/cm²密度接種于培養(yǎng)皿中，按1.75×10⁵cells/mL培養(yǎng)液的量加入含體積終濃度10％FBS的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)4-5天后收集上層培養(yǎng)液，離心除去細胞碎片，上層清液經(jīng)0.22μm濾膜抽濾，濾液即為HepG2條件培養(yǎng)液；所述誘導(dǎo)液Ⅰ終濃度組成為：體積濃度5％FBS、10ng/ml IGF-1、25ng/ml EGF、1×N2、1×B27、50ng/mLFGF3、50ng/mL FGF10、50ng/mL肝素鈉，溶劑為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液；

(2)將生長至90％匯合度的雞胚橢圓囊間質(zhì)細胞用含終濃度2μg/ml絲裂霉素C的DMEM培養(yǎng)液浸泡，在37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時，棄去培養(yǎng)液，細胞用pH值為7.4的PBS緩沖液洗滌，即為預(yù)處理后的雞胚橢圓囊間質(zhì)細胞；

(3)用accutase消化步驟(1)獲得的毛細胞前體細胞，靜置沉淀，棄去沉淀，將細胞懸液以10⁵個/cm²的密度接種至預(yù)處理后的雞胚橢圓囊間質(zhì)細胞上，加入誘導(dǎo)液Ⅱ，在37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)誘導(dǎo)3-4周，獲得含內(nèi)耳毛細胞的培養(yǎng)液，收集內(nèi)耳毛細胞；所述誘導(dǎo)液Ⅱ終濃度組成：體積濃度5％FBS、25ng/ml EGF、1×N2、1×B27、10μM RA、5μM DAPT，溶劑為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液。